Mesenkymale stamceller

Blant de regionale stamceller okkuperer mesenkymale stamceller (MSCs) et spesielt sted, hvorav derivatene utgjør stromalmatrisen av alle organer og vev i menneskekroppen. Prioritet i MSCs forskning tilhører representanter for russisk biovitenskap.

I midten av forrige århundre ble en homogen kultur av multipotente stromale beinmargestamceller først isolert i laboratoriet av A. Friedenshtein. Stamceller som er festet til et substrat for en lang tid beholdes en høy formeringshastigheten, og kulturene ved lav pode densitet etter fiksering på et substrat dannet av fibroblast-cellekloner som ikke har noen fagocytisk aktivitet. Stoppet av MSC-proliferasjon ble avsluttet ved spontan in vitro-differensiering i ben-, fett-, brusk-, muskel- eller bindevevceller. Videre studier har gjort det mulig å etablere det osteogene potensialet av fibroblastlignende celler i beinmargstromen av forskjellige pattedyrsarter, så vel som deres kolonidannende aktivitet. Ved forsøk in vivo ble det vist at både hetero- og ortotopisk transplantasjon av fibroblast-kolonidannende celler er fullført danner ben, brusk, og fibrøst fettvev. Siden benmargstamceller har en høy kapasitet til selvfornyelse og en rekke differensiering innenfor en enkelt cellelinje, har de blitt betegnet multipotente mesenkymale stamceller.

Det skal bemerkes at i 45 års grunnleggende undersøkelse av mesenkymale stamceller er det opprettet reelle forhold for bruk av derivater i klinisk praksis.

I dag er det ingen tvil om at alle vev i menneskekroppen dannes fra stamceller fra forskjellige cellelinjer som følge av prosesser med spredning, migrasjon, differensiering og modning. Imidlertid ble det nylig antatt at stamceller i den voksne kroppen er vevsspesifikke, det vil si i stand til å produsere spesialiserte cellelinjer bare av vevene de er plassert i. Denne konseptuelle situasjonen ble avvist av fakta om transformasjon av hematopoietiske stamceller, ikke bare til cellulære elementer av perifert blod, men også til ovale leverceller. I tillegg kunne neurale stamceller gi opphav til både nevroner og glial elementer, samt tidlige engasjert linjer av hematopoietiske stamceller. I sin tur kan mesenkymale stamceller, som vanligvis produserer cellulære elementer av bein, brusk og fettvev, forvandle seg til neurale stamceller. Det antas at i prosessen med vekst, fysiologisk og reparativ vevsregenerering, genereres ubetingede stamceller fra vevsspesifikke stamreserver. For eksempel kan reparasjon av muskelvev realiseres ved hjelp av mesenkymale stamceller som migrerer fra beinmarg til skjelettmuskler.

Selv om slike kryss ombyttbarhet stamceller gjenkjenner ikke alle forskere muligheten for klinisk bruk av stamceller som en kilde for celletransplantasjon og celle-vektor av genetisk informasjon ikke rider som multi stromale benmargstamceller, som kan være forholdsvis lett å isolere og forplanter i kultur in vitro. På samme tid i den vitenskapelige litteraturen fortsetter å dukke opp rapporter om potensialet i pluripotente stamceller i benmargen stroma. Som bevis frem forskning protokoller, som under påvirkning av spesifikke indusere av transdifferensiering av MSCer omdannes til nerveceller, kardiomyocytter og hepatocytter. Men noen forskere anledning til å re-aktivering og genekspresjon i løpet av tidlig embryogenesen i alvorlig tvil. Samtidig, forstår alle at hvis forholdene er funnet å utvide multi stamceller til pluripotency av ESCs i regenerativ medisin og plast automatisk løst mange problemer av etisk, moralske, religiøse og juridisk art. Videre, siden i dette tilfellet kilden til stammen evne til reproduksjon av pasienten er autologe stromale celler er løst, og problemet med immun avvisning av celletransplantat. Hvor virkelige disse utsiktene er, vil nær fremtid vise.

[1], [2], [3], [4]

Bruk av mesenkymale stamceller i medisin

Klinikken bruk av derivater av stamceller er forbundet primært med reduksjonen av vevsdefekter forårsaket av store og dype termiske lesjoner i huden. Preklinisk eksperimentell evaluering av hensiktsmessigheten av allogene fibroblast-lignende stamceller for behandling av dype brannsår ble utført. Det er vist at fibroblast-lignende benmarg stamceller danner et monolag i kulturen, noe som gjør det mulig å transplantere dem for å optimalisere regenerering av dype brannsår. Forfatterne oppmerksom på at tilsvarende egenskaper har embryonale fibroblaster, men klinisk anvendelse av sistnevnte er begrenset til de eksisterende etiske og juridiske problemer. Dyp termisk forbrenning med PWA-kreftet ved alle lag av huden modellert på Wistar-rotter. Brennens areal var 18-20% av hudens totale overflate. I den første forsøksgruppe besto av rotter med lav termisk skade og transplantasjon av allogene fibroblast-avledede stamceller. Den andre gruppen bestod av dyr med dype forbrenninger og trans-plantasjen av allogene embryonale fibroblaster. Den tredje gruppen var representert av kontrollrotter med dyp termisk brenning, som ikke utførte celleterapi. En suspensjon av fibroblast-avledede stamceller og embryoniske fibroblaster ble påført på en brannsåret flate pipettert i en mengde på 2 x 10 ⁴ celler på dag 2 etter utskjæring av brenning modellering og nekrotisk brannskorpe dannet. Etter transplantasjon, cellene brenne overflate dekket med gas fuktet i isotonisk natriumklorid-løsning med gentamicin. Gjerdebenmargceller for å oppnå MSC-er med påfølgende induksjon av fibroblast-linje i stamceller som produseres hos voksne Wistar-rotter fra lårben. Embryoniske fibroblaster ble oppnådd fra lungene med 14-17 dag gamle embryoer. Embryonale fibroblaster og benmargceller for å oppnå en pre-MSC-er ble dyrket i petriskåler ved 37 ° C i en C02 iikubatore, i en atmosfære med 5% CO2 ved 95% fuktighet. Embryonale fibroblaster ble dyrket i 4-6 dager, mens den for monolaget dannelse MSC kreves fra 14 til 17 dager. Deretter MSC-er opprettholdt ved nedfrysing som et utgangsmateriale for fibroblast-avledede stamceller som ble fremstilt ved tining og dyrking av MSC-ene i 4 dager. Antall fibroblast-genererte stamceller er mer enn 3 ganger antallet embryoniske fibroblaster som oppstår i løpet av den samme dyrkningsperioden. For å identifisere celler i transtslantirovannyh brannsår i trinn dyrking av deres genom merket ved anvendelse av virale pendelvektor basert på en rekombinant adenovirus V typen bærer 1AS-2-gen som koder for P-galaktosidase E. Coli. Levende celler til forskjellige tidspunkter etter transplantasjon detektert immunohistochemically i frysesnitt med tilsatt substrat X-Gal, som gir den karakteristiske blå-grønn farge. Som et resultat av visuell dynamikk, posisjonell og histologisk evaluering tilstanden brannsår, ble det funnet at selv på tredje dagen etter transplantasjon av cellene i isolerte grupper vises signifikante forskjeller i løpet sårtilhelingsprossessen. Spesielt tydelig, denne forskjellen ble den syvende dagen etter celletransplantasjon. Dyrene i den første gruppen, som ble transplantert fibroblast-lignende stamceller, sår ervervet jevnt rosa intens farge, granulasjonsvev vokste over hele sitt areal til nivået av overhuden, og brenne overflaten er betydelig redusert i størrelse. Kollagenfilmen dannet på overflaten av såret ble noe tynnere, men den fortsatte å dekke hele brenningsområdet. Dyrene i den annen gruppe, som ble transplantert embryonale fibroblaster, blir granulasjonsvev løftes til nivået for pasientens epidermis over sårkantene, men bare på enkelte steder, samtidig plazmoreya fra såret var mer intens enn i gruppe 1, og opprinnelig dannet kollagenfilm praktisk talt forsvunnet. I dyr som ikke fikk stamcelleterapi, på den syvende dag brannsåret var en blek, korroderte, nekrotisk vev, belagt med fibrin. Plasmorrhea ble observert gjennom brennoverflaten. Histologisk dyrene i 1. Og 2. Gruppene viste en nedgang på cellulær infiltrasjon og utvikling av blodkar, har disse tegn på begynnende regenerator prosessen vært mer alvorlig i rottene i gruppe 1. I kontrollgruppen viste tegn på celle viklet infiltreringen, histologisk mønster av nylig dannede blodkar fraværende. 15-30 th observasjonsdag dyrene i den første gruppen brennoverflateareal var betydelig mindre enn i de rottene i andre grupper, og granulerende overflate var mer utviklet. I dyrene i den andre gruppen brennoverflateareal er også redusert sammenlignet med størrelsen av forbrenningssår i kontrollgruppen av rotter som var på grunn av marginal epitelisering. I kontrollgruppen brenne overflate områder forble blek granulasjoner med sjeldne, som gjengis på disse edderkopp årer, holmer var fibrinous plakett fortsatt moderat plazmoreya tvers brenne overflaten, noe som er vanskelig avtakbar skabb forble. Generelt dyrene i gruppe 3 reduserer også størrelsen av såret, men såret forble podrytymi kant.

Således, i løpet av en sammenlignende studie av sårtilheling priser ved hjelp av fibroblast-avledede stamceller og føtale fibroblaster, og uten bruk av celleterapi markert akselerasjon av helingen av brannsår overflate som et resultat av transplantasjon av fibroblast-avledede stamceller og embryoniske fibroblaster. Imidlertid, i tilfellet med anvendelse av allogene stamceller av fibroblast sårlegende var høyere enn i transplantasjon av embryonale fibroblaster. Dette ble vist i akselererende endring av restitusjon faser av prosessen - for å redusere cellulær infiltrasjon perioder, øker frekvensen av proliferasjon av vaskulære nettverk, så vel som dannelsen av granulasjonsvev.

Resultater av dynamisk planimetri indikerer at hastigheten av spontan helbredelse av brannsår (uten bruk av celleterapi) var lavest. På den 15. Og 30. Dag etter transplantasjon av allogene stamceller av fibroblast sårheling var høyere enn i transplantasjon av embryonale fibroblaster. Histokjemisk metode for påvisning av beta-galaktosidase viste at etter transplantasjon av fibroblast-lignende mesenchymale stamceller og embryoniske fibroblaster gjennom hele observasjonsperioden på overflaten og dype sår regenererings transplanterte cellene forblir levedyktig. Forfatterne antyder at en høyere rate av forbrenningssår regenerering ved hjelp av stamceller fra fibroblast betinget frigivelse ved hjelp av disse cellene under modning rostostimuliruyushih bioaktive faktorer.

Transplantasjon av autologe eller allogene keratinocytter og allogene fibroblaster for behandling av brannsår og anvendelse i klinikken. Det bør bemerkes at kirurgisk behandling av barn med omfattende dype brannskader er en komplisert oppgave på grunn av den høye mangfold av traumer og kirurgiske inngrep, betydelig blodtap, på de ulike reaksjonene som brukes infusjon medier. De største vanskeligheter ved gjennomføringen av hud og plastisk kirurgi med omfattende dype forbrenninger, det areal som overstiger 40% av kroppsoverflaten, på grunn av alvorligheten av hennes tilstand og mangel på ressurser av donor hud. Bruken av maske grafts med stor perforeringsforhold løser ikke problemet, siden bildet etter epiteliziruyutsya celle perforering er meget langsom, og ofte gjør hudtransplantater lyseres eller tørr. Slike belegg brannsår som ksenokozha, avdød allotransplantater, syntetiske filmbelegg er ikke alltid tilstrekkelig effektive, slik at utvikling av nye metoder for lukking av brannskade overflatelag av dyrkede keratinocytter og fibroblaster. Spesielt er en fremgangsmåte for å lukke forbrennings overflater ved hjelp dyrket allofibroblastov gir under transplantasjon markert stimulerende effekt på proliferasjonen epidermotsitov bevart i såret grensen ved forbrenning, og i keratinocytt grafts mesh duk. I Budkevich L. Et al (2000) viser resultatene av å anvende denne fremgangsmåte for behandling av brannskader hos barn. 31 barn med termisk traumer i alderen 1 til 14 år var under observasjon. På tre barn totale areal av brannsår IIIA-B - IV graden var 40%, 25 - 50 til 70%, selv ved de tre - 71 til 85% av kroppsoverflaten. Tidlig kirurgisk nekrosektomi ble kombinert med transplantasjon av dyrket allof fibroblaster og autodermoplasti. I det første behandlingstrinn ble gjennomført nekrotisk vev excision, den andre - i transplantasjon av dyrkede allofibroblastov bærerfilmen, den tredje (48 timer etter transplantasjon av dyrkede allofibroblastov) - fjerning av matrise og hudlapper med autodermoplasty perforering forholdet 1: 4. Tre pasienter innlagt i klinikken med alvorlig brennesykdom, dyrket allof fibroblaster ble transplantert i granuleringssår. Transplantasjon av dyrket allo-fibroblaster ble utført en gang hos 18 barn, to ganger i 11 og tre ganger hos to pasienter. Arealet av såroverflaten dekket av cellekulturen var fra 30 til 3500 cm2. Effekt av dyrkede allofibroblastov evaluert ved total prosentandel av innpoding av hudlapper, tidspunkt for helbredelse av brannsår og antall dødsfall alvorlig termisk skade. Engraftment av transplantasjoner var fullført hos 86% av pasientene. Et delvis ikke-utseende av hudflapper ble registrert i 14% tilfeller. Til tross for pågående behandling døde seks (19,3%) barn. Det totale hudlesjonsområdet i dem var fra 40 til 70% av kroppsoverflaten. Transplantasjon av dyrket allo-fibroblaster var ikke relatert til det fatale utfallet av en brennskade i noen pasient.

Analysere resultatene av behandlingen, forfatterne oppmerksom på at tidligere brannsår uforenlig med liv, til å behandle dype varmeskader på huden området 35-40% av kroppsoverflaten (for små barn - inntil 3 år - er kritiske dype brannskader med et areal på 30%, for eldre barn alder - over 40% av kroppsoverflaten). Når kirurgisk transplantasjon av dyrkede necrectomy allofibroblastov autodermaplasty og påfølgende hud grafts med store brannskader, perforering faktor IIIB - IV grad fortsatt kritisk, men i øyeblikket er det utsikter i mange tilfeller for å redde livet til selv slike ofre. Kirurgisk necrectomy i forbindelse med transplantasjon av dyrkede allofibroblastov og autodermaplasty hos barn med dype brannsår vist seg å være spesielt effektiv i pasienter med fremskredne lesjoner i huden med et underskudd av donorsteder. Aktiv kirurgisk taktikk og transplantere dyrket allofibroblastov fremme hurtig stabilisering av den generelle tilstanden til slike pasienter, reduksjon av antallet infeksiøse komplikasjoner av forbrennings sykdom, skaper gunstige forhold for innpoding, redusere tiden for å gjenopprette den tapte hud og varighet av behandling på sykehus, redusere forekomsten av dødsfall hos pasienter med omfattende forbrenninger. Således, transplantasjon av dyrkede allofibroblastov fulgt autodermaplasty hudlapper oppnår bedring i barn med alvorlige forbrenninger, som tidligere ble betraktet som dømt.

Det er allment anerkjent at det primære målet med å behandle en brennesykdom er å maksimere full og rask gjenoppretting av skadet hud for å forhindre de resulterende toksiske effekter, smittsomme komplikasjoner og dehydrering av kroppen. Resultatene av anvendelsen av dyrkede celler avhenger i stor grad av beredskapen for transplantasjon av selve brennssåret. Ved transplantasjon av dyrkede keratinocytter til sårflaten etter kirurgisk necrectomy prizhivlyaetsya et gjennomsnitt på 55% (basert på areal) av transplanterte celler, mens det på den granulerende sår innpoding hastigheten er redusert til 15%. Derfor krever vellykket behandling av omfattende dype hudforbrenninger i første omgang aktiv kirurgisk taktikk. I nærvær av brennsår IIIB-IV grad, blir brennoverflaten umiddelbart frigjort fra nekrotisk vev for å redusere virkningen av forgiftning og redusere antall komplikasjoner av brannsykdom. Bruken av slike taktikker er nøkkelen til å redusere tiden fra tidspunktet for brenning til sår nedleggelse og lengden på oppholdet av pasienter med omfattende brannskader på sykehus, men også reduserer antall dødsfall betraktelig.

De første rapportene om vellykket bruk av kultiverte keratinocytter til å dekke brennoverflaten, oppstod tidlig i åttitallet av forrige århundre. Deretter ble denne manipulasjonen utført ved hjelp av lag av kultiverte keratinocytter, oppnådd oftest fra autostrukturer, mye mindre ofte fra allokeratinocytter. Imidlertid tillater teknologien for autokeratinocytoplastikk ikke opprettelsen av en cellebank, mens tiden som kreves for å produsere et tilstrekkelig transplantat fra keratinocytter, er stort og beløper seg til 3-4 uker. I løpet av denne perioden øker risikoen for å utvikle smittsomme og andre komplikasjoner av brennsykdom kraftig, noe som signifikant forlenger pasientens totale lengde på sykehuset. I tillegg overlever autokeratinocytter praktisk talt ikke når de transplanteres i granulerende brennsår, og den høye prisen ved spesielle vekstmedier og biologisk aktive keratinocyttvoksstimulerende midler begrenser deres kliniske anvendelse signifikant. Andre bioteknologiske metoder, som kollagenoplastikk, transplantasjon av kryopreserverte xenoider, og bruken av forskjellige biopolymerbelegg øker effektiviteten av behandling av omfattende overflater, men ikke dype forbrenninger. Metoden for å belegge såroverflaten med dyrkede fibroblaster er fundamentalt forskjellig ved at hovedkomponenten i dyrkede cellebasseng ikke er keratinocytter, men fibroblaster.

En forutsetning for utviklingen av fremgangsmåten tjente som bevis for at pericytter som omgir de små kar er pro- genitornymi mesenchymale celler i stand til å omdannes til fibroblaster, som produserer mange vekstfaktorer og gir leging av sår på grunn av den sterk stimulerende virkning på proliferasjonen og adhesjon av keratinocytter. Ved hjelp av dyrkede fibroblaster for lukking av såroverflater umiddelbart identifisert en rekke vesentlige fordeler ved denne fremgangsmåte fremfor bruken av dyrkede keratinocytter. Spesielt er det ingen fremstilling av fibroblaster i kultur krever ikke bruk av spesielle vekstmedium og vekstfremmende midler, noe som reduserer kostnadene ved transplantasjon mer enn 10 ganger omkostningene for oppnåelse keratinocytter. Fibroblaster er lett utsatt for passering, hvor de delvis mister sin overflate histokompatibilitetsantigener, som igjen gjør det mulig å anvende for fremstilling av allogene transplantasjoner av celler og lage sine banker. Forkorter som mottar transplantater, klar for bruk i en klinikk, fra 3 uker (keratinocytter) av 1-2 dager (fibroblaster). Primære kulturer av fibroblaster kan oppnås ved å dyrke celler fra huden fragmenter tatt ved autodermoplasty og celleutsåingen tetthet på kvitterings subkulturer av humane fibroblaster er bare 20 x 10 ³ per 1 cm ².

For å studere effekten av fibroblaster og deres regulatoriske proteiner i proliferasjon og differensiering av keratinocytter, en komparativ analyse av egenskapene og morfologi av keratinocytt-proliferasjon på substrater av kollagentyper I og III og fibronectin i ko-kultur med humane fibroblaster. Humane keratinocytter ble isolert fra hudfragmenter hos pasienter med forbrenninger tatt under operasjonen av autodermoplastikk. Tettheten av keratinocytter var 50 x 103 celler pr cm2. Den kliniske effekten av transplantasjon av dyrkede fibroblaster ble evaluert hos 517 pasienter. Alle pasientene var delt inn i to grupper: 1 - voksne påvirket av brannskader IIA, B - IV grad; 2. - Barn med dype brannsår av IIIB - IV grad. Vurdering av dynamikken i strukturelle og funksjonelle organiseringen av monolagskultur av fibroblaster med hensyn til den rolle i regenereringsprosessen av glykosaminoglykaner, fibronektin, kollagen, og tillot forfatterne for å bestemme den tredje dag som de mest gunstige betingelser for anvendelse av fibroblastkulturer for produksjon av transplantater. Undersøkelse av virkningen på fibroblast proliferasjon og differensiering av keratinocytter viste at under in vitro-fibroblaster har en uttalt stimulerende virkning, først og fremst på keratinocytt-adhesjonsprosesser, øker antallet adherente celler og frekvensen av feste mer enn 2 ganger. Stimulering adhesjonsprosesser ledsaget av en øket intensitet av DNA-syntesen og nivået av keratinocyttproliferering. Videre ble det funnet at tilstedeværelsen av fibroblaster og ekstracellulær matriks som dannes av dem er en forutsetning for dannelsen tonofibrillyarnogo apparat keratinocytt intercellulære forbindelser og, til slutt, for keratinocytt-differensieringen og basalmembrandannelsen. I behandlingen av barn med dype brannsår etablert klinisk effekt av transplantasjon allofibroblastov kultur, spesielt hos pasienter med omfattende skader i huden donorsteder i underskudd. Komplekset morfofunktcionalnoe studie viste at pode karakterisert fibroblaster aktiv DNA-syntese, så vel som kollagen, fibronektin og glykosaminoglykaner, som genereres i cellene i den ekstracellulære matriks. Forfatterne foreslår at en høy prosentandel av innpoding av transplanterte fibroblaster (til 96%), en kraftig reduksjon i forhold til deres fremstilling (i løpet av 2-3 timer i stedet for 24-48 uker i tilfelle av keratinocytter), en betydelig akselerasjon av helingen av det brennoverflaten, og en betydelig reduksjon i pris (i 10 ganger) av teknologien for å dyrke graft fra fibroblaster i sammenligning med keratinocyttransplantasjon. Bruken av transplantasjon av dyrkede allofibroblastov gjør det mulig å redde livet til barn med kritiske brannsår - termisk skade over 50% av kroppsoverflaten, som tidligere ble antatt uforenlig med liv. Det er bemerkelsesverdig at allogen transplantasjon av embryonale fibroblaster også overbevisende måte vist seg ikke bare raskere regenerering av sår og rekonvalesens pasienter med varierende grad brenne og området, men også en betydelig reduksjon av dødelighet.

Autologe fibroblaster blir brukt på en slik komplisert og plastisk kirurgi som en erstatning korreksjon skade stemmebåndene. Vanligvis brukes bovin kollagen til dette formål, hvis varighet er begrenset av dens immunogenicitet. Være et fremmed protein, bovint kollagen, kollagenase følsom for mottakeren, og kan føre til immunreaksjoner, for å redusere faren som teknologien for kollagen-preparater er blitt utviklet, tverrbundet med glutaraldehyd. Deres fordel er større stabilitet og lavere immunogenisitet, som har funnet praktisk anvendelse i fjerning av defekter og stemmebånd atrofi. Injeksjoner av autologt kollagen ble først brukt i 1995. Metoder gitt konservering av den primære strukturen av autologe kollagenfibre, herunder enzymatisk katalysert intramolekylære tverrbindinger. Det faktum at naturlige kollagenfibre er mer motstandsdyktige mot å nedbrytes av proteaser enn rekonstituert kollagen-telopeptider karakterisert snitt. Integritet telopeptider viktig for den kvaternære struktur av kollagenfibrene og kryssbinding mellom tilstøtende kollagenmolekylene. I motsetning til preparater av bovint kollagen, betyr autologt kollagen ikke forårsake immunresponser hos mottakeren, men det er ikke tilstrekkelig effektive som fyller middel. Vedvarende korreksjon kan oppnås ved lokal produksjon av kollagen ved autolog fibroblasttransplantasjon. Men etterforskningen av effektiviteten av transplantasjon av autologe fibroblaster i klinikken avdekket noen problemer. I den første perioden etter transplantasjonen fibroblast kliniske virkning var svakere sammenlignet med den etter administrering av bovint kollagen. Når dyrkede autologe fibroblaster ikke kan utelukke muligheten for transformasjonen av normale fibroblaster i unormal, de såkalte myofibroblasts, som er ansvarlige for utviklingen av fibrose og arrdannelse, noe som fremgår ved reduksjon i kollagengel, på grunn av den spesifikke interaksjon av fibroblaster og kollagenfibriler. Videre kan etter at den serielle aging fibroblaster in vitro mister sin evne til å syntetisere ekstracellulære matriksproteiner.

Foreløpig er det imidlertid eksperimentell teknikk perfeksjonert dyrking av humane autologe fibroblaster, noe som eliminerer de ovennevnte ulemper og fører til onkogenisk transformasjon av normale fibroblaster. Autologe fibroblaster oppnådd ved denne metoden brukes til å fylle defekter i mykvevet i ansiktet. I en studie av H. Keller og medforfattere (2000) mottok 20 pasienter i alderen 37 til 61 år med rynker og atrofiske arr behandling. Hudbiopsier (4 mm) BTE region vi transportert til laboratoriet i sterile rør inneholdende 10 ml kulturmedium (Dulbecco antibiotikum mikoseptikom, pyruvat og føtalt bovint serum). Materialet ble plassert i 3-5 kultivarer med en diameter på 60 mm og inkubert i en termostat med en atmosfære inneholdende 5% C02. Etter 1 uke ble cellene fjernet fra oppvasken ved trypsinisering og plassert i 25 cm2 hetteglass. Celler blir administrert til pasienter i en mengde på 4 x 107. Betydelig og langvarig klinisk effekt ble observert i pasienter med korreksjons nasolabial folder, og i pasienter med arr etter 7 og 12 måneder etter den tredje transplantasjon av autologe fibroblaster. Ifølge strømningscytometri produserte dyrkede fibroblaster en stor mengde type I kollagen. In vitro-studier er den normale kontraktiliteten for injiserbare fibroblaster vist. To måneder etter subkutan administrering av dyrkede fibroblaster i en dose på 4 x 107 celler, ble det ikke påvist nakenmus. Injiserbare fibroblaster forårsaket ikke arrdannelse og diffus fibrose hos pasienter. Ifølge forfatteren er de implanterte autologe fibroblaster i stand til å produsere kollagen kontinuerlig, noe som vil gi kosmetisk foryngelseseffekt. I dette tilfellet, siden livslengden av differensierte celler er begrenset, er fibroblaster tatt fra en ung pasient mer effektive enn de som er oppnådd hos eldre mennesker. I fremtiden antas muligheten for cryopreservering av en fibroblastkultur tatt fra en ung donor å senere transplantere til en eldre pasient sine egne unge celler. Som konklusjon er det ikke helt riktig konklusjon at autologe fibroblaster under betingelse av deres funksjonelle bevaring er det ideelle middel for korrigering av defekter i myke vev i ansiktet. Samtidig oppfatter forfatteren selv at det i prosessen med forskning oppsto noen problematiske situasjoner knyttet til bruk av et autologt fibroblast-kollagen-system. Den kliniske effekten var ofte svakere enn ved bruk av oksekollagen, noe som forårsaket skuffelse hos pasienter.

Generelt ser litteraturdataene ut på utsiktene for klinisk bruk av mesenkymale stamceller ganske optimistisk. Forsøk gjøres for å anvende autologe benmarg-multipotente mesenkymale stamceller for behandling av degenerative leddsår. De første kliniske forsøkene på dyrkede mesenkymale stamceller i behandlingen av komplekse bruddbrudd utføres. Autologe og allogene mesenkymale stromale benmargsceller brukes for å generere brusk vev for transplantasjon i korreksjon av leddbruskdefekter på grunn av trauma eller autoimmune lesjoner. Praktiserte metoder for klinisk anvendelse av multipotente mesenchymale stamceller som å korrigere bendefekter i barn med alvorlig osteogenesis fremgang forårsaket av mutasjoner av type I kollagen-genet. Etter mieloabelyatsii barn-mottakere av transplantert benmarg fra HLA-kompatibel frisk giver som ufraksjonert benmarg kan inneholde en tilstrekkelig mengde av stamceller for å etterfylle alvorlig bendefekt. Etter transplantasjon, allogen benmargs slike barn markert positive histologiske forandringer i trabekulært ben, økning av veksthastighet og reduksjon i forekomsten av benbrudd. I noen tilfeller oppnås et positivt klinisk resultat ved å transplantere nært besluttet allogent benmarg og osteoblaster. For behandling av medfødt skjørhet av bein på grunn av ubalanse mellom osteoblaster og osteoklaster i beinvev, blir MSK-transplantasjon også brukt. Restaurering av bendannelse i dette tilfellet oppnås på grunn av chimerisering av bassenget av stamme og stamcellerstromalceller i pasientens bindevev.

Metodene for genetisk modifikasjon av donor mesenkymale stamceller blir forbedret for å korrigere genetiske defekter av stromale vev. Det er antatt at mesenchymale stamceller som snart vil bli brukt i Neurology for retnings chimerization hjerneceller og skape en pool av friske celler, i stand til å generere mangelfulle enzym eller faktor som er ansvarlig for de kliniske manifestasjoner av sykdommen. Transplantasjon av stamceller kan bli anvendt for å gjenopprette benmargstroma hos kreftpasienter etter radioterapi og kjemoterapi, og i kombinasjon med benmargsceller - for restaurering av hematopoiesis. Utvikling av substitusjonsterapi sikte på å eliminere manglene i muskel-skjelettsystemet ved hjelp av MSCer fremme teknikk i designmatrisen biomaterialer eller biomimics danner skjeletter bebor avkommet av stamceller.

Kilder til mesenkymale stamceller

Den viktigste kilden til stamceller er benmarg hematopoetiske stamceller som hos pattedyr er i stadig differensiere til blodceller og immunsystemet, mens stamceller presentert små populasjoner av fibroblast-lignende stromale benmargsceller og å opprettholde den udifferensierte tilstand av hematopoetiske stamceller. Under visse betingelser, mesenchymale stamceller differensierer til celler av brusk og ben. Når belagt på et dyrkningsmedium i lave plantetetthet mononukleære stromale benmargsceller danne kolonier av adherente celler, som i virkeligheten er fibroblast multipotente mesenchymale forløperceller. Enkelte forfattere har foreslått at benmargs deponert-iverk mesenchymale stamceller, som, takket være evnen til å fornye seg selv og høy differensiering potensial, gir alle vev i kroppen forløpere mesenchymal stromale celler gjennom hele livet pattedyrorganisme.

I benmargen danner stromalcelleelementer et nettverk som fyller mellomrummet mellom sinusoider og beinvev. Innholdet av sovende MSC i beinmarg hos en voksen er sammenlignbart med antall hematopoietiske stamceller og overstiger ikke 0,01-0,001%. Mesenkymale stamceller isolert fra beinmarg og ikke utsatt for dyrking er blottet for klebende molekyler. Slike MSC'er uttrykker ikke CD34, ICAM, VCAM, type I og III kollagen, CD44 og CD29. Derfor, in vitro-stamceller er ikke festet på dyrkingssubstratet, og mer avanserte forløperceller avledet stamceller, har dannet cytoskjelett komponenter og mottakerinnretning av celleadhesjonsmolekyler. Stromceller med fenotypen CD34 er funnet selv i perifert blod, selv om de er mye mindre i beinmarg enn CD34-positive mononukleære celler. CD34-cellene isolert fra blodet og overført til kulturen festet til substratet og danner kolonier av fibroblastlignende celler.

Det er kjent at i den embryonale perioden stammer bunnen av alle organer og vev av pattedyr og mennesker fra et felles basseng mesenchymale stamceller før og på stadiet av organogenese. Derfor antas det at i en moden kropp skal de fleste mesenkymale stamceller være i bindevev og benvev. Det har blitt fastslått at flertallet av cellulære elementer i stroma av løs bindevev og beinvev er representert av engasjerte stamceller, som imidlertid beholder evnen til å proliferere og danne kloner in vitro. Ved innføring av slike celler i den totale blodstrømmen, blir mer enn 20% av mesenkymprogenitorcellene implantert blant stromalelementene i hematopoietisk vev og parenkymorganene.

En potensiell kilde for mesenchymale stamceller er fettvev, blant hvilke forpliktede stamceller som finnes i varierende grad av adipocytt-forløpere. Minst modne progenitor elementer av fettvev - stromale-vaskulære celler, som er den samme som multipotente mesenkymale progenitorer i benmargen kan differensiere til adipocytter under virkningen av glukokortikoider, insulinlignende vekstfaktor og insulin. I kulturen av stromale vaskulære celler differensierer til adipocytter og kondrocytter og fettvev benmarg-avledede celler som er dannet adipocyter og osteoblaster.

I musklene ble også stromale stamkilder funnet. I primærkulturen av celler isolert fra humane skjelettmuskler, oppdages celler av stellatform og multinucleerte myotuber. I nærvær av hesteserum stel prolifererer in vitro, uten tegn til cytodifferentiation og etter tilsetting av deksametason til kulturmediet av differensiering er karakterisert ved utseendet av celleelementer celler med fenotype av skjelett- og glattmuskel, ben, brusk, og fettvev. Følgelig er både engasjerte og ukompliserte multipotente mesenkymale progenitorceller tilstede i det menneskelige muskelvev. Det er vist at en populasjon av progenitorceller som er tilstede i skjelettmuskel kommer fra ukommitterte multipotente benmargs mesenchymale stamceller i, og skiller seg fra myogeniske satellittceller.

I hjertet hos nyfødte rotter også funnet klebestellate cells, passende for differensiering potensialet av multipotente mesenchymale progenitorceller, som under påvirkning av deksametason de differensierer til adipocytter, osteoblaster, kondrocytter, glatte muskelceller, myotuber av skjelettmuskel og hjertemuskelceller. Det er blitt vist at vaskulære glatte muskelceller (pericytes) er avledet av multipotente udifferensiert perivaskulær mesenchymale forløperceller. I kulturen av perivaskulære stamceller uttrykker en-glatt muskel aktin og blodplate-avledet vekstfaktor-reseptor, og er i stand til å skille i det minste glatte muskelceller.

Et spesielt sted, når det gjelder stamreserver, er det bruskvæv, hvis ekstremt lave reparative potensial antas å skyldes mangel på multipotente mesenkymale stamceller eller differensiering og vekstfaktorer. Det antas at de multipotente mesenkymale progenitorceller forhåndsgjennomført til kondro- og osteogenesen kommer inn i det bruskvæv fra andre vevskilder.

Vevs opprinnelse og betingelser for provisjon av mesenkymale stamceller i senene er heller ikke etablert. Ekspermentalnye observasjoner antyder at i tidlige postnatale kanin Achilles seneceller i primære kulturer i den første passasje og beholde ekspresjon av kollagen type I og decorin, men ved dyrkning de mister tenotsitov differensieringsmarkører.

Det bør bemerkes at svaret på spørsmålet om faktisk lokalisert i forskjellige vev av multipotente mesenchymale stamceller som alltid er til stede i deres stroma, eller vev basseng av stamceller kompenseres ved migrering av stromal benmarg stamceller, er det fortsatt ventet.

I tillegg til benmarg og andre mesenkymale vevsoner av en voksen organisme, kan en annen kilde til MSC være ledningsblod. Det har vist seg at navlestreng vene blod inneholder celler som har lignende morfologiske og antigene egenskaper med multipotente mesenchymale stamceller som er i stand til adhesjon, og ikke dårligere multipotente mesenchymal progenitorceller i benmargen opprinnelse ved differensiering potensial. I kulturer av stamceller fra navlestrengblod er oppdaget fra 5 til 10% ikke-iverkmultipotente mesenchymale stamceller. Det viste seg at deres antall i ledningen blod er omvendt proporsjonal med svangerskapslengde, som er indirekte bevis for vandringen av multipotente mesenchymale stamceller i forskjellige vev i løpet av fosterutvikling. Det var først informasjon om klinisk anvendelse av de stamceller isolert fra navlestrengsblod, samt embryonale avledet biomateriale, som er basert på den kjente evne hos føtale stamceller integrere og funksjon prizhivlyatsya i organer og vev systemer voksen mottakere.

Søket etter nye kilder til mesenkymale stamceller

Bruken av mesenkymale stamceller av embryonisk opprinnelse, som andre føtale celler, skaper en rekke etiske, juridiske, juridiske og lovgivningsmessige problemer. Derfor fortsetter søket etter ekstraembryonisk cellulært donormateriale. Forsøk var mislykket klinisk anvendelse av humane hudfibroblaster, ble det bestemt ved ikke bare den høye økonomiske kapasiteten teknologi, men også rask differensiering av fibrocytt inn i fibroblaster som har betydelig mindre potensiell spredning og produserer et begrenset antall vekstfaktorer. Ytterligere fremskritt i å studere biologi av MSK og multipotente mesenkymale benmargsprecursorer tillot utviklingen av en strategi for klinisk bruk av autologe mesenkymale stamceller. Teknologien til isolering, dyrking, reproduksjon av vivo og rettet differensiering krevde først og fremst studiet av molekylære markørspekteret av MSCs. Deres analyse viste at i de primære kulturer av humant benvev finnes det flere typer multipotente mesenkymale stamceller. Pro-osteoblastfenotypen ble funnet i celler som uttrykker en markør for stromale forløperceller STRO-1, men som ikke bærer en osteoblast-markør-alkalisk fosfatase. Slike celler kjennetegnes av en lav evne til å danne en mineralisert benmatrise, så vel som fraværet av ekspression av osteopontin og parathyroidhormonreseptoren. Derivater av STRO-1-positive celler som ikke uttrykker alkalisk fosfatase, er representert ved mellomliggende og fullstendig differensierte osteoblaster. Det er fastslått at de cellulære elementene av klonede linjer av STRO-1-positive celler av humane trabekulære bein er i stand til å skille seg i modne osteocytter og adipocytter. Retningen differensiering av disse cellene er avhengig av eksponering av flerumettede fettsyrer, proinflammatoriske cytokiner - IL-1b og tumornekrosefaktor a (TNF-a), så vel som anti-inflammatoriske og immunundertrykkende TGF-b.

Senere ble det funnet at multipotente mesenchymale forløperceller mangler spesifikke bare for de iboende fenotype, men uttrykke komplekse markører, karakteristiske for mesenchymale, endoteliale, epiteliale og muskelceller i fravær av ekspresjon av hematopoetiske celleantigener immunophenotypic - CD45, CD34 og CD14. I tillegg, mesenchymale stamceller og konstitutivt inducibly produsere hematopoietisk og ikke-hematopoietiske vekstfaktorer, interleukiner, og kjemokiner, og i multipotente mesenkymale forløperceller uttrykte reseptorer for enkelte vekstfaktorer og cytokiner. Blant stromale celler grunnleggende av det menneskelige legeme funnet dormantnye eller hvilende celler med immunfenotypen, nesten identisk med den antigene profilen av rå 5-fluorouracil multipotente mesenchymale stamceller i - disse og andre celler som uttrykker CD-117, som markerer "voksen" stamceller.

Dermed er en cellemarkør unik for mesenkymale stamceller ennå ikke blitt etablert. Det antas at hvilende celler er ikke-iverk populasjoner av multipotente mesenchymale forløperceller fordi de ikke uttrykker cellemarkører av forpliktet til osteoartritt (Cbfa-1) eller adipogenese (PPAR-y-2). Den langvarige eksponeringen av langsomt prolifererende hvileceller til føtalt kalveserum fører til dannelsen av terminalt differensierte forløpere, karakterisert ved rask vekst. Klonal vekst av slike stamme mesenkymale celler støttes av FGF2. Det ser ut til at genomet-avledet stromal stamceller "lukket" tett nok har blitt rapportert om fravær av spontan differensiering i MSC-er -. Uten spesielle betingelser for å binde den til og med er de ikke omdannes til celler av mesenkymal serie.

For å studere populasjonsstrukturen avledet stamceller som er søkt differensiering markørproteiner på stromale cellelinjer og primære kulturer. I klonale colony assay Benmargsceller in vitro funnet at når den utsettes for primærkulturer av EGF øker den gjennomsnittlige størrelse av koloniene og reduserer klonal ekspresjon av alkalisk fosfatase, mens tilsetningen av hydrokortison aktiverer ekspresjon av alkalisk fosfatase, som er en markør for osteogen differensiering av MSCene orientering. Monoklonale antistoffer mot stro-1 har gjort det mulig å separere og studere populasjoner av stro-1-positive adherente celler i et heterogent system Dexter kulturer. Spekteret av cytokiner regulere ikke bare proliferasjon og differensiering av hematopoietiske og lymfoide celler, men også delta i formasjonen, dannelsen og resorpsjonen av skjelettvev av para-, auto- og endokrine mekanismer. Reseptor-formidlet frigivelse av sekundære budbringere slik som cAMP, diacylglycerol, inositol-trifosfat, og Ca2 + er også brukt for markør analyse av forskjellige kategorier av stromale vev av celler som uttrykker relevante reseptorer. Anvendelsen av monoklonale antistoffer som markører tillates å etablere stromale lymfoide organer som tilhører retikulære celler for T og B-avhengige soner.

For en stund fortsatte vitenskapelige konflikter rundt spørsmålet om muligheten for opprinnelsen til MSC fra hematopoietisk stamcelle. Faktisk, med eksplanteringen av suspensjonen av benmargceller i monolagskulturer, vokser selvklare kolonier av fibroblaster i dem. Imidlertid har det vist seg at tilstedeværelsen av forløpere for fibroblast kolonier og forskjellige bakterier differensiering av hematopoetiske vev som en del av benmargen er ikke bevis for deres felles opphav av hematopoetiske stamceller. Ved hjelp av diskriminant analyse av benmargstamceller funnet at mikromiljøet ved heterotopisk transplantasjon, hematopoetiske celler i benmargen blir overført, noe som beviser eksistensen, i benmargen uavhengig av histogenetic MSC populasjon av hematopoietiske celler.

I tillegg selektiv kloning fremgangsmåte åpenbares i monolagkulturer av stromale benmargsceller i en ny kategori av forløperceller for å bestemme deres antall, for å studere deres egenskaper, proliferative og differensiering potensial. Det ble funnet at in vitro-fibroblast-lignende stromale celler formerer seg og danner diploide kolonier som når revers transplantasjon inn i legemet som sikrer dannelsen av nye bloddannende organer. Resultatene av studier av individuelle kloner tyder på at det er en populasjon av celler i deres proliferative og differensiering potensial kunne kreve rollen til stamcellene ifølge stromalvevet, Gistogeneticheskaja uavhengig av hematopoetiske stamceller i stromal progenitorcellene. Celler av denne populasjonen er preget av selvbærende vekst og skiller seg i stamceller fra bein, brusk og retikulært benmargvev.

Av stor interesse er resultatene av studier Chailakhyan R. Et al (1997-2001), som var dyrket benmargavledede stromal progenitorceller kaniner, marsvin og mus av a-MEM-kulturmedium supplert med fetalt kalveserum. Forfatterne utførte eksplanteringen med en innledende tetthet på 2-4 x 103 beinmargceller per 1 cm2. Som føder ble homologe eller heterologe strålingsinaktiverte benmargceller anvendt i en dose som holdt feedervirksomheten, men fullstendig blokkering av deres proliferasjon. To ukers primære diskrete kolonier av fibroblaster ble trypsinert for å produsere monoklonale stammer. Bevis klonal opprinnelse kolonier ble oppnådd ved anvendelse av kromosommarkører i blandede kulturer av benmarg fra hann- og hunnkjønnsmarsvin, time-lapse skyte levende kulturer, så vel som i blandede kulturer av benmarg fra syngeniske mus og CBA SVAT6T6. Transplantasjon oppslemning av nylig isolerte benmargsceller dyrket in vitro eller stromale fibroblaster under nyrekapselen ble utført i ivalonovyh porøse stillas eller gelatin, så vel som inaktivert kanin cancelløst ben matrise. Transplant kloner inn i benet dekselet lårene marsvin renset fra bløtvev og periosteum, kutt epiphysis og grundig vasking av deres benmarg. Benet ble kuttet i fragmenter (3-5 mm), tørket og bestrålt i en dose på 60 Gy. I de benete dekslene ble individuelle fibroblastkolonier plassert og implantert intramuskulært. For intraperitoneal transplantasjon av stromale fibroblaster, dyrket in vitro, anvendte vi typene A diffusjonskammer (V = 0015 cm 3, h = 0, l mm) og D (V = 0,15 cm 3, h = 2 mm).

Ved undersøkelse av dynamikken i vekst av klonale stammer Chailakhyan R. Et al (2001) fant at de individuelle cellene, kolonidannende fibroblaster, så vel som deres etterkommere har stort proliferativ potensial. Ved det 10. Passasje var antall fibroblaster i noen stammer 1,2-7,2 x 10 ⁹ celler. I prosessen med utviklingen utførte de opptil 31-34 celle duplikasjoner. Således heterotopisk transplantasjon av benmarg-avledede stammer dannet av stromale forløpere flere dusin kloner førte til overføring av mikromiljøet i benmargen og utdannelse i den nye sonen hematopoetisk organtransplantasjon. Forfatterne reiste spørsmålet om hvorvidt individuelle kloner kan tåle mikromiljøet i benmargen stromale celler, eller det krever samarbeid med flere forskjellige klonogen stromal forløper-? Og hvis individuelle kloner vil være i stand til å overføre mikromiljøet, enten det er fullt av alle tre bakterie blod, eller forskjellige kloner gi dannelsen av blodkreft mikromiljøet for ulike bakterier? For å løse disse problemene har blitt utviklet teknologi for dyrking stromale stamceller i kollagen gel som gjør at du kan skyte fra overflaten av fibroblaster dyrket kolonier for påfølgende heterotop transplantasjon. Individuelle kloner stromale fibroblaster, benmargsceller dyrket fra CBA-mus og marsvin, kuttet sammen med et fragment av gelcoat og transplantert heterotopisk - under nyrekapselen på syngeniske mus eller autologe muskelbuk marsvin. Ved transplantasjon i muskelen ble koloniene på gelen plassert i de benete dekslene.

Vi har funnet at ved 50-90 dager etter transplantasjon av benmarg fibroblast koloni i 20% av tilfellene ble observert i transplantasjon områdeutvikling av bein eller bein og blodkreft vev. I 5% av mottakende dyr som dannes lommer av ben med et hulrom fylt med benmarg. Inne i ben sylindre slike brennpunkter har en avrundet form og en kapsel laget av benvev, med osteocytter og godt utviklet osteoblastisk lag. Benmarg hulrom inneholder nettlignende stoff med myeloide og erytroide celler var andelen som ikke skiller seg fra den i normal benmarg. Nyrene graft var en typisk medullær legemet som dannes av nativ benmargstransplantasjon, hvor ben kapsel dekker bare medullærhulrommet fra nyrekapselen. Hematopoetisk vev inkludert myeloid, megakaryocytic og erytroid elementer. Stroma av margkanalen ble bihuler godt utviklet og inneholdt typisk fettcellesystemet. På samme tid som ligger i området av transplantasjon av noen kolonier ben med ingen tegn til hematopoiesis ble det funnet under nyrekapselen. Studie av proliferative og differensiering potens av individuelle kloner ble videreført på monoklonale kanin benmarg-stammer, blir cellene resuspendert i kulturmedium og i et separat ivalonovoy svamp som veide 1-2 mg trukket under nyrekapselen på kanin benmarg donor. Slike celler ble underkastet autotransplantasjons 21 monoklonalt belastning. Resultatene ble tatt i betraktning om 2-3 måneder. Forfatterne fant at 14% av de transplanterte benmarg monoklonale stammer formet legeme bestående av ben og benmarg hulrom fylt med hematopoetiske celler. I 33% av tilfellene transplanterte stammene dannet kompakt ben med forskjellig størrelse hulrom ostootsitami murt i osteoblastisk og utviklet lag. I noen tilfeller, svamper transplanterte kloner utviklet retikulum uten ben eller hematopoietiske celler. Noen ganger retikulære stroma dannelsen skjedde med et godt utbygd nett av sinusoids, men ikke befolket hematopoetiske celler. Således er de oppnådde resultater var de samme som de som ble oppnådd ved transplantasjon av klonene i kollagengel. Men hvis kloner transplantasjon dyrket på substratet resulterte i dannelse av margvevet er 5% av bein - 15% og det retikulære stoff - i 80% av tilfellene, belaster transplantasjon monoklonale dannelsen av benmargceller ble observert i 14% av tilfellene av ben - i 53% og retikulær - i 53% av tilfellene. Ifølge forfatterne indikerer dette at betingelsene for gjennomføring av proliferative og differensierings potensialene til stromale fibroblaster når transplanterte på porøse stillasene var mer optimal enn med sine transplantater i ben og dekker kollagen substratet. Det er ikke utelukket at bruk av mer avanserte metoder for dyrking og transplantasjon av kloner tilbakemelding kan forbedre forholdene for gjennomføringen av dens kloner differensiering potensialer og endrer disse forbindelser. En eller annen måte, men den største verdien av forskningen ligger i det faktum at noen av klonene stromale celler i stand til å danne benvev og samtidig sikre stromal hematopoetiske mikromiljøet umiddelbart for tre spirer av benmarg blod: erytroide, myeloid og megakaryocytic, og skaper et stort nok footholds hematopoietisk vev og litt benmasse.

Videre forfatterne opp spørsmålet om kapasiteten for disse typene av cellulær differensiering av individuelle klonogene stromal stamceller i et lukket system av diffusjonskamre. Videre var det nødvendig å bestemme hvorvidt individuelle kloner av pluripotente utstilling eller skjerm for å skille potensielle krever samarbeid samspill av flere kloner med en fast tegn cytodifferentiation, annet forhold som bestemmer den foretrukne dannelsen av ben, brusk eller retikulære. Ved å kombinere to metodiske fremgangsmåter - monoklonalt isolerer stromale benmargsstamceller og transplantere dem inn i diffusjonskamre, Chailakhyan R. Et al (2001) oppnådde resultater som tillot å nærme forståelsen av den strukturelle organiseringen av benmargstroma. Transplantasjon monoklonale stammer stromale stamceller til type O-celler resulterte i dannelsen av både ben og brusk vev, som viser evnen hos avkom av en kolonidannende stromale celler samtidig som danner ben og brusk. Forutsetningen om at bein og brusk væv stammer fra den felles stromale stamceller har gjentatte ganger blitt gjentatt. Denne hypotesen hadde imidlertid ikke en korrekt eksperimentell bekreftelse. Ben- og bruskdannelse i diffusjonskamre var nødvendig for å bevise eksistensen av stamceller inkluderer stromale benmargs forløperceller som er felles for disse to typer av vev.

Deretter 29 klonale stammer andre og tredje passasjer, primære kulturer avledet fra benmargen i kaniner ble plassert i diffusjonskamre og implantert intraperitonealt homolog dyr. Studier har vist at 45% av monoklonale benmargestammer har osteogene potensiale. Unntaket inneholdt retikulært vev 9 kamre, men sammen med bein og bruskvæv var det til stede i 13 flere kamre, som utgjorde 76% av alle stammene. I kamre av type O, hvor differensiering var mulig for både bein og brusk, ble 16 stammer undersøkt. I fire kamre (25%) ble både ben- og bruskvæv dannet. Det skal igjen bemerkes at de studiene Chailakhyan R. Et al (2001) enkelt progenitorceller gikk cellestamme som består av fra 31 til 34 doblinger, og deres avkom var 0,9-2,0 x 10 ⁹ celler. Antallet mitoser som forløperceller fra polyklonale stammer ble utsatt for, var praktisk talt det samme som for cellene i de monoklonale stammene. Således tallet for utvikling av polyklonale stammer, spesielt i den første fase av deres dannelse, til en stor grad avhengig av antall kolonier anvendes for å initiere stammer. Diploide stammer av humane embryonale fibroblaster (WI-38) for å 12-15 reklonirovanii th dobling nivåer også dannet kolonier forskjellig diameter og i sitt innhold av celler. Store kolonier inneholdende mer enn 103 celler var bare 5-10%. Med økningen i antall divisjoner, ble andelen av store kolonier redusert. Mono- og polyklonale stromale benmargs fibroblast-stammer beholdt en diploid kromosomsett etter 20 eller flere doblinger, og tendensen til utvikling var sammenlignbar med dynamikken i diploide stammer embryonale fibroblaster. Analyse av differensiering potensialet av spesifikke stromale benmargsstamceller, utført ved transplantasjon av monoklonale stammer i diffusjonskamre, viste at halvparten av dem osteogen. Store kolonier utgjorde 10% av sitt totale antall. Følgelig korresponderte antallet osteogene kolonidannende celler til omtrent 5% av deres totale populasjon. I den totale massen av osteogene stamceller identifisert av forfatterne, var det celler som var i stand til å danne bein og bruskvæv samtidig. For første gang funnet at for disse to typer av vev i den voksne organismen er den felles forløpercelle: 25% av de testede kloner ble laget av like celler, og deres antall i den generelle befolkningen av progenitorceller var ikke mindre enn 2,5%.

Dermed har heterotopisk transplantasjon av individuelle kloner av benmargsfibroblaster åpnet nye aspekter av den strukturelle organisasjonen av populasjonen av mesenkymale stamceller. Funnet stromal progenitorceller som er i stand til å overføre spesifikke mikromiljøet umiddelbart for alle hemopoietisk stammen, som blandt de undersøkte kloner større på forskjellige modeller er fra 5 til 15% (0,5 til 1,5% av det totale antall stamceller som er detektert). Sammen med klonene, overfører kompmikromiljøet i benmargen, er det progenitorceller, deter bare til bendannelse, som dannes når de overføres til et åpent system, benet som ikke støtter utviklingen av hematopoiesis. Deres tall fra det totale antall stamceller er 1,5-3%. Noen av disse cellene kan danne benvev med en begrenset periode med selvvedlikehold. Følgelig er populasjonen av stromal stamceller heterogen i sitt differensieringspotensial. Blant dem er det en celle kategori, hevder rollen til stromal stamceller som er i stand til å differensiere til alle tre dimensjoner som ligger i benmarg stromale vev og danner ben, brusk og retikulære vev. Disse dataene tillate oss å håpe at med hjelp av ulike cellemarkører vil være mulig å bestemme bidraget av hver type stromale celler i mikromiljøet av den spesifikke organisasjonen og støtte hematopoiesis i Dexter kulturer.

Egenskaper av mesenkymale stamceller

I de senere år, er det funnet at i stasjonære kulturer av benmarg mesenchymale multipotente stamceller som presentert en begrenset populasjon av små agranular celler (RS-1) celler, kjennetegnet ved lav evne til kolonisering og fravær av Ki-67-antigenekspresjon spesifikk for voksende celler. Antigene parametere dormantnyh RS-1-celler er forskjellig fra spektret for begått antigener hurtig delende stromal progenitorceller. Det ble funnet at en høy proliferasjonsprosent av engasjerte progenitorceller bare ble observert i nærvær av RS-1-celler. I sin tur, RS-1-celler øker veksthastigheten under påvirkning av faktorer utskilt av de mest modne avledet multi mesenchymale progenitorceller. Det ser ut til at RS-1-celler er en underklasse av ubestemte MSCer som er i stand til resirkulering. In vitro resistent overfor 5-fluorouracil stromal progenitorceller i benmargen kjennetegnet ved et lavt RNA-innhold og et høyt nivå av ekspresjon av ornithin-decarboxylase gene - markør ikke-prolifererende celler.

Intensiv gjengivelse av stromal stamceller begynner etter fiksering på substratet. Når dette uttrykkes markør profilen til svakt differensierte celler: SH2 (TGF-P-reseptor (3), SH3 (domene signale protein), kollagen type I og III, fibronektin, adhesjonsreseptor VCAM-1 (CD106) og ICAM (CD54), cadherin-11 , CD44, CD71 (transferrinreseptor), CD90, CD120a og CD124, men uten ekspresjon av karakteristiske markører av hematopoetiske stamceller (CD34, CD14, CD45). Klonevekst gjør det mulig gjentatte ganger blitt passert stamceller for å fremstille en kultur av mange genetisk homogene stromal forløper- pluripotent celler. Cerea 2-3 passering av deres tallet når 50-300000000. I kulturen i tilstrekkelig densitet etter å stoppe proliferasjonen av stromal progenitorceller, i motsetning til hematopoietiske vev fibroblaster differensiere til adipocytter, myocytter, bruskceller, og benvev. Kombinasjonen av de tre differensierings regulatoriske signaler omfattende 1-metyl-izobutilksantin (induser av intracellulært cAMP-dannelse), dexametason (en inhibitor av fosfolipase A og C) og indometacin (en syklooksygenaseinhibitor, tromboksan senkende aktivitet og) svinger i adipocytter opptil 95% av progenitor mesenkymceller. Adipocytt dannelse fra umodne stromale celler bekreftet ekspresjon av lipoprotein lipase-genet, histokjemisk identifikasjon av apolipoproteiner og peroxysomal reseptorer. Celler fra den samme klon påvirket av TGF-b i serumfritt medium skaper en homogen populasjon av kondrocytt. Den flerlags cellekultur av brusk ekstracellulær matriks er kjennetegnet utviklet bestående av proteoglykan og kollagen type II. Den næringsmedium med 10% føtalt serum virkning differensieringssignaler kompleks bestående av B-glycerofosfat (donator uorganisk fosfat), askorbinsyre og deksametason, i de samme kultur stromale progenitor progenitor-celler fører til dannelsen av celleaggregater. I slike celler, er det en progressiv økning i aktiviteten av alkalisk fosfatase og osteopontin-nivåer, noe som indikerer dannelsen av benmineralisering hvilke celler bekreftet en progressiv økning i intracellulært kalsium.

Ifølge noen, til evnen til stamceller deler på ubestemt tid og reproduksjon av forskjellige typer av mesenchymale linjeceller kombinert med en høy grad av plastisitet. Når den administreres inn i ventriklene, eller hvit substans stamceller migrere inn i parenchyma av nervevev og differensiere til neuronal eller glial avledet cellelinje. I tillegg er det informasjon om MSC transdifferensiering i hematopoetiske stamceller både in vitro og in vivo. En mer inngående analyse i noen studier bestemt eksepsjonelt høy duktilitet av MSC-ene, som er manifestert i deres evne til å differensiere til oligodendrocytter, astrocytter, nevroner, kardiomyocytter, glatte muskelceller og skjelettmuskelceller. I et antall studier transdifferentsirovochnogo potensialet av MSCer in vitro og in vivo funnet at multipotente mesenchymal forløperceller benmarg opprinnelse terminalt differensiere til cellelinjer som danner ben, brusk, muskel, nerve og fettvev, samt sener og stroma som støtter hematopoese .

Imidlertid, i andre studier, ingen tegn til begrensning pluripotency genomet av mesenchymale stamceller og kunne ikke påvises stromal stamcellepopulasjoner, men for å kontrollere eventuelle pluripotent stromale celler ble undersøkt mer enn 200 MSC-klonene isolert fra et primærkultur. De aller fleste in vitro-kloner beholdt evnen til å differensiere til osteogene, chondrogen og adipogene retninger. Når utelukke sannsynligheten for migrering av mottakercellene ved transplantasjon av stamceller under nyrekapselen eller i diffusjonskamre det vist seg at stromal forløperceller in situ beholde heterogen fenotype, som indikerer enten fravær av en sone transplantasjon restriksjonsfaktorer eller fravær av pluripotente MSCer alene. Samtidig tillot eksistensen av en sjelden type somatiske pluripotente stamceller, som er felles forløpere for voksne stamceller.

På fler, men ikke sann pluripotente stamceller utgjør en meget liten brøkdel av benmargceller og er i stand til, i visse tilfeller, når de dyrkes in vitro til å formere seg uten å komme i differensiering, hvilket vises ved deres indusert avstamning engasjement av celler i ben, brusk, fett, muskler , så vel som i tenocytter og stromale elementer som støtter hematopoiesis. Typisk kontinuerlig eksponering i kulturmedium med føtalt kalveserum provoserer utgangs MSCer i stromal av engasjerte forløperceller, hvor avkommet undergår spontan endelige differensiering. In vitro mulig å oppnå retningsosteoblast formasjon ved å tilsette til mediet kondisjone deksametason, ß-glycerofosfat og askorbinsyre, mens kombinasjonen av differensiering signaler deksametason og insulin induserer dannelse av adipocytter.

Fastslått at før inntreden i fasen av terminal differensiering av benmarg MSCer for å skape visse dyrkingsbetingelser til å begynne å differensiere til fibroblast-lignende stamceller. Derivater av disse cellene in vivo er involvert i dannelsen av ben, brusk, sener, fett og muskelvev, så vel som stromal støtte hematopoiesis. Mange forfattere forstå begrepet "multi mesenchymale stamceller" som faktisk MSC, og de engasjerte stromal stamceller og benmarg mesenchymale vev. Klonal analyse av mesenchymale multipotente progenitorceller i benmargen opprinnelse viste at noe mer enn en tredjedel av klonene differensierte i osteo-, hondro- og adipocytter, mens andre kloner celler ha osteogene potensial og en form bare hondro- og osteocytter. Denne klon av multipotente mesenchymale forløperceller som IUD-9, under egnede betingelser mikro differensiert i celler med en fenotype og funksjonelle egenskaper ikke bare av osteoblaster, kondrocytter og ADIC potsitov men stromale celler som støtter hematopoiesis. Isolert fra rottefoster-benmargceller klone RCJ3.1 differensierte mesenchymale celler med forskjellige fenotyper. Ved den kombinerte virkning av askorbinsyre, b-glyserofosfat, og deksametason fra cellulære elementer av denne klon blir først dannes flerkjernede myocytter og deretter, suksessivt, adipocytter, kondrocytter og holmer mineralisert benvev. Populasjonen av granulære celler fra periosteum av rottefostre tilsvarer iverksatte multipotente mesenchymale stamceller som, som kjennetegnes ved en lav hastighet av proliferasjon, ikke uttrykker markører for differensiering, og differensiert i dyrkningsbetingelser for å danne hondro-, osteo- og adipocytter og glatte muskelceller.

Således bør det bemerkes at spørsmålet om plyuri- eller multipotency genomet av stamceller er fremdeles åpen, hvilket følgelig påvirker presentasjonen av differensiering potensialet til stromale progenitorceller, som også er ikke fullstendig installert.

Eksperimentelt påvist og viktig egenskap ved stamceller er deres evne til å forlate vevet nisje og sirkulere i den generelle sirkulasjon. For å aktivere det genetiske programmet for differensiering, bør slike sirkulerende stamceller falle inn i det passende mikromiljøet. Det er vist at når de administreres systemisk til blodet MSC-er resipientdyr umodne celler implantert i ulike organer og vev, og deretter differensiert i blodceller, myocytter, adipocytter, kondrocytter og fibroblaster. Følgelig, i de lokale vevsområder oppstår Signal-regulerende interaksjon av engasjerte og stromal-iverk progenitorceller, samt mellom disse og de omgivende modne celler. Det antas at den differensierings-induksjons utføres parakrine regulatoriske faktorer av mesenkymal opprinnelse og nemezenhimalnogo (vekstfaktorer, eikosanoider, ekstracellulære matriks-molekyler) som vil gi de romlige og tidsmessige relasjoner i mikromiljøet av multipotential mesenchymale stamceller. Derfor bør lokale skader fra mesenchymale vev fører til dannelsen av en mikromiljøet soner multipotente mesenchymale forløperceller skiller seg kvalitativt fra de komplekse regulatoriske signaler intakt vev i hvilke fysiologiske prosesser som forekommer i stedet for reparativ regenerering. Denne forskjellen er ekstremt viktig når det gjelder spesialisering av cellefenotypen i en normal og skade-indusert mikromiljø.

Ifølge ideene er det her at mekanismene til den grunnleggende forskjellen mellom to kjente prosesser - fysiologisk regenerering og inflammatorisk spredning - legges. De første av dem avsluttes med restaureringen av spesialisert cellulær vevsammensetning og dens funksjon, mens resultatet av proliferasjonsprosessen er dannelsen av modne bindevevselementer og tap av funksjon av den skadede vevsone. For utvikling av optimale programmer for bruk av multipotente mesenkymale stamceller i regenerativ plastmedisin, er det derfor nødvendig med en nøye undersøkelse av egenskapene ved påvirkning av mikromiljøfaktorer på differensiering av MSC.

Avhengighet av strukturen av rommet av stamceller på cellulære para- og autokrine regulatorer, hvis uttrykk moduleres av eksterne signaler, tviler ingen. Blant funksjonene til regulatoriske faktorer, er de viktigste kontrollen av asymmetrisk deling av MSCs og uttrykket av gener som bestemmer trinnene i kommisjonen og antall celledivisjoner. Eksterne signaler, som videreutviklingen av MSC avhenger av, er gitt av deres mikromiljø. I uutviklede MSCS å proliferere tilstrekkelig lang tid, samtidig som evnen til å differensiere til adipocytter linje, myofibroblasts, hematogenous stromalvev, bruskceller, og ben. Det er funnet at et begrenset populasjon av sirkulerende SB34-negative stromale celleelementer fra det generelle kretsløp blir returnert til benmargstroma vev, blir transformert inn i en linje der CD34-positive hematopoetiske stamceller. Disse observasjoner tyder på at de resirkuleringen progenitor mesenchymale celler i blodet av vev gir støtte for balanse av stromale stamceller i forskjellige organer ved å mobilisere felles forråd av umodne stromale benmargsceller. Differensiering av MSC-ene i celler med flere mesenchymale fenotyper og deres deltagelse i reparasjon eller regenerering av ben, brusk, sener og fettvev in vivo vist ved adoptiv overføring modeller i forsøksdyr. I henhold til andre forfattere, er fjernt migrering av MSC-ene karseng kombinert med en lokal forskyvning eller korotkodistantnym multipotente mesenchymal forløperceller i vevet ved reparasjon brusk, muskel regenerering, og andre reduksjonsreaksjoner.

Lokale reserver stem stromale vev fundamenter spille en rolle kilde av celler i en fysiologisk vev regenereringsprosesser og etterfylles ved å fjerne transport MSCer som lomme stromale vev stilk ressurser. Imidlertid har behov for nødstilfelle mobilisering av cellulært reparative kapasitet, slik som multippel traume, i reparerende prosesser regenerering deltar MSCer hele toget, og periferien gjennom blodet rekruttert mesenchymale forløperceller benmarg.

Transplantasjon av mesenkymale stamceller

Det er visse paralleller mellom prosesser av fysiologisk regenerering av vev og deres dannelse i løpet av perioden med intrauterin utvikling. Den embryogenese hos mennesker og pattedyr, dannelsen av forskjellige typer av spesialiserte celler avledet fra ecto, meso og endodermal kimlag basseng, men med den obligatoriske deltakelse av mesenkym. Det løse mobilnettet av embryonalt mesenkymvev utfører mange regulatoriske, metabolske, skjelett- og morfogenetiske funksjoner. Bokmerke for provisorisk legemer utføres bare etter at den kondenserende mesenchyme på bekostning av vekst klonogene progenitorceller som genererer primær morfogenetisk signaler organogenese. Stromal avledet embryonale mesenkym skape stillas provisorisk legemer og danner grunnlaget for fremtidig energoplasticheskogo sikre på grunn av veksten av de primære vaskulære og lymfatiske kar. Med andre ord, stromalelementene i mikrocirkulatorisk enhet av føtalorganene forekommer før dannelsen av deres strukturelle funksjonelle enheter. I tillegg gir aktiv migrering av mesenchymale celler under organ romlig orientering utvikling av organer på grunn av merkingen sine grenser ved volum Restriction homeotiske Hox-tepov. På stromal stillas er det også en samling av strukturelle og funksjonelle enheter av parenkymatiske organer, som ofte inneholder morfogenetisk og funksjonelt helt forskjellige celler. Følgelig er mesenkymfunksjoner i embryogenese primære og realiseres ved å generere regulatoriske signaler som aktiverer regional proliferasjon og differensiering av progenitorielle epitelceller. Embryoniske mesenchymceller produserer vekstfaktorer som LEG, HGF-b, CSF, for hvilke parenkymale stamceller har tilsvarende reseptorer. De modne differensierte vev av voksen organismen stromacellelinje kretsen genererer også signaler for å opprettholde levedyktigheten og proliferasjon av progenitorceller nemezenhimalnogo opprinnelse. Imidlertid spektrum stromale regulatoriske signaler i postnatal ontogenese andre (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, FLT-3, LIF, etc.) og er rettet mot å gi fysiologisk regenerering eller reparasjon av skadede vevssoner. Videre er de spektrale egenskapene til stromal regulatoriske faktorer i hver type vev og selv innenfor samme organ forskjellige. Spesielt hematopoiese og lymfopoese til multiplikasjon og differensiering av hematopoetiske og immunkompetente celler som forekommer bare i visse organer, som virker innenfor stromal mikromiljø som gir betingelser for modning av hematopoetiske og lymfoide celler. Det er opp til regulatoriske faktorer mikromiljøet er avhengig av evnen av hematopoetiske og lymfoide celler for å repopulere kroppen til å formere seg og modnes til dets mikrostruktur nisjer.

Blant de komponenter av den ekstracellulære matriks, som produserer multipotente mesenchymal forløperceller, bør det legges merke til fibronektin, laminin, kollagen og proteoglykaner, så vel som CD44 (hyaluronan og osteopontin-reseptor) som mottar hoveddelen i organiseringen av den intercellulære interaksjoner og dannelsen av ekstracellulær matriks i benmargen og ben . Det er bevist at benmargs mesenchymal, multipotente celler skape redshestvenniki stromal mikromiljøet, noe som gir de induktive og regulatoriske signaler ikke bare den MSC, men også hematopoietiske forløpere og nemezenhimalnye benmarg stamceller. Det er kjent at MSC-er som er involvert i hematopoesen målt ved deres evne til å differensiere til stromale celler som støtter hematopoese, karakterisert ved at den aktive veiledning MSK signal som oppnås direkte fra hematopoetiske stamceller. Det er derfor kulturen av nettverks stromal forløperceller er grunnlaget for mating av alle kloner av hematopoetiske celler.

I en moden organisme intensitet av hemodialyse og lymfopoese i en tilstand av dynamisk likevekt med "utgifter" av modne blodceller og immunsystemceller i periferien. Siden benmarg stromale celler og lymfoide organer sjelden oppdatert, betyr betydelige omstillinger stromale strukturer ikke forekomme i dem. Bringe systemet av dynamisk likevekt er mulig ved hjelp av mekanisk skade på noen organer hemo eller lymfopoese, noe som fører til den samme type av sekvensielle endringer som påvirker ikke bare, og ikke så mye av hematopoietiske eller lymfoide celler, som stromale strukturer skadet organ. I prosessen med reparative regenerering primært dannet stromal rammeverk, som deretter repopulating hematopoetiske eller immunceller. Dette lenge kjent faktum gjør posttraumatisk regenerering passende modell for å studere stromal mikromiljøet av bloddannende organer. I særdeleshet, for undersøkelse av reparativ regenerering av benmarg anvendes mekanisk tømming medullærhulrommet av lange knokler - utskrapning, slik at til raskt og effektivt å bringe de hematopoetiske vev fra en tilstand av dynamisk likevekt. Når man studerer prosessen med reparative regenerering av hematopoetiske og stromale benmargs komponenter etter mekanisk tømming av marghulen av tibia marsvin funnet at mellom indikatorer regenerering av hematopoetiske og stromale celler (antall av hematopoetiske celler, konsentrasjonen og mengden av stromal progenitorceller) er det ingen direkte korrelasjon. I tillegg ble det funnet at økningen i bestanden av stromale stamceller skjer på et tidligere tidspunkt etter utskrapning, og selv stromale fibroblaster er fosfatazopolozhitelnymi, som er karakteristisk for osteogent vev. Det ble også fastslått at utskrapning 3-5 lange ben fører til vekst av cellepopulasjonen i benmargen og ikke-opererte ben selv i milten, som i marsvin er bare lymfopoietiske legeme.

Morfologiske bilde reparative prosesser i benmargen kyuretirovannyh tibiale marsvin tilsvarer generelt litteraturdata oppnådd ved eksperimenter på dyr av andre arter, dynamikken i endringene som finner sted etter fjerning av det hematopoetiske vev er den samme for alle arter og forskjellen bare gjelder de tidsparametre . Morfologisk fase fremgangsmåte for å gjenopprette hematopoesen i medullærhulrommet tømmes i etterfølgende prosesser å organisere blodproppdannelse grov fiber ben, dets resorpsjon av sinusoider og retikulære formasjon stroma, noe som ytterligere repopulerende hematopoetiske elementer. Antallet av hematopoetiske forløperceller i benmarg vevsregenerering prosessen øker i parallell økning i innholdet av hematopoetiske stamceller.

Gerasimov Yu et al (2001) i forhold til endringer i antall av hematopoetiske celler og mengden av stromale celleforløpere i de enkelte faser av regenereringsprosessen. Det ble funnet at kvantitative forandringer i benmargceller i ben kyuretirovannoy varer med dynamikken i morfologiske karakteristika regenerering. Reduksjon i løpet av de første tre dagene av celleinnholdet i regenerere Forfatterne tilskriver tap av hematopoetiske celler på grunn av de uheldige virkninger av mikromiljøet, noe som skaper retikulære vev vokser i de resterende benmargen i epifysen og i den sistnevnte for å danne foci osteoid og vaskulære skader med utskrapning. 7-12 th dag heve yaderosoderzhaschih celler faller sammen med fremkomsten av den enkelte foci i myeloide hematopoietiske stromale celler spredningssoner. På den 20. Dagen er det betydelige deler av den regenererte benmargen og velutviklede bihulene, som er ledsaget av en betydelig økning i total celle nummer. Imidlertid er antallet av hematopoetiske celler i dette tidsrom var 68% av kontrollnivåene. Dette er i overensstemmelse med tidligere publiserte data som viser at antallet av bloddannende celler etter utskraping når standarder bare 35 til 40 dager etter operasjonen.

I den tidlige posttraumatiske perioden er hovedcellulærkilden for restaurering av hemopoiesis de cellulære elementene bevart i curettagen. Senere er hovedkilden til regenerering av benmargs hematopoietisk vev stamceller som repopulerer de frie stromalzonene. For visse kategorier av stromceller (endotel, retikulær og osteogen) forblir kildene som gir dannelsen under rekonstruksjonen av medulær hulrom uforklarlig. Resultatene av Yu.V. Gerasimov og medforfattere (2001) vitner om at i beinmerg konservert etter curettage er konsentrasjonen av celler som danner fibroblast kolonier betydelig høyere enn i det normale benmargen. Forfatterne mener at med utskrapning er mer intens selektiv eluering av hematopoetiske celler sammenlignet med stromal kolonidannende celler som er involvert i dannelsen av stroma og mer fast forbundet med sin basisk substans enn hematopoetiske celler.

Dynamikken av endringer i antallet celler som danner kolonier fibroblaster korrelerer med intensiteten av osteogenesepromoter prosesser påfølgende trabeklære ben-resorpsjon og dannelse retikulære stroma som befolke hematopoetiske celler. De fleste stromal stamceller danner et grovfibrøst beinvev og en retikulær stroma ved de angitte regenereringstider. For brudd i lårbenet i betingelser forlenget osteosyntese på den femte dag i regenereringssonen øker konsentrasjonen av celler og antallet kolonidannende fibroblaster, og bendannelse i intensiv deres antall økes med 6 ganger. Det er kjent at beinmargceller som danner fibroblastkolonier, har osteogene egenskaper. Antallet stromal progenitorceller øker før kolonisering av området av den cortexed benmarg av hematopoietiske celler. Dette er i god enighet med bevis på at stromceller gir dannelsen av et hematopoietisk mikromiljø. Selvfølgelig, etablering av hematopoetisk mikromiljøet svarer til en viss grad av regenerering av stromale vev, og øker antallet av hematopoetiske celler etter ekspansjon stromal brohode egnet for hematopoiese.

Av størst interesse er forfatterne av data som umiddelbart etter utskrapning høyere antall stromale celleforløpere i fjerntliggende deler av skjelettet. Med start fra den sjette time, og etter den tyvende dagen inkluderende av den kontralaterale tibia er observert i mer enn to gangers økning i konsentrasjonene, og antallet celler som danner kolonier av fibroblaster. Mekanismen for dette fenomen er sannsynligvis forbundet med det faktum at en massiv benmargsskade som resulterer i dannelsen av et stort antall av blodpropper og samtidig ødelegger et betydelig antall blodplater og slipper inn i blodplate-avledet vekstfaktor (RBSK), som er kjent for å forårsake formeringen av celler som danner kolonier fibroblaster plassert i kroppen utenfor det proliferative bassenget. I eksperimenter på kaniner lokal administrasjon MSCer fremmer restaurering av kirurgisk skadet brusk av kneet, som kan være assosiert med dannelsen av kondrocytter avledet fra MSC-er innført. Imidlertid reparative regenerering av bendefekter i laboratorierotter er betydelig forbedret ved bruk av stamceller innesluttet i en keramisk ramme. Derfor kan vi anta at hvis man ikke gjør det rbok, da en hvilken som helst annen faktor, som stammer fra de skadede stromale celler, har en fjern stimulerende virkning på proliferasjonen av mesenchymale stamceller som i intakte deler av benmargen og stimulerer deres migrering inn i området av defekten benmarg vev. I sin tur, dette i motsetning til litteraturdata fra tidligere år, noe som indikerer at stromale celler er ansvarlige for mikromiljøet, i motsetning til hematopoetiske celler er ikke i stand til å migrere og kommer fra lokale kilder.

Ikke desto mindre, resultatene av studien Gerasimov Yu et al (2001) at anvendelsen av mekanisk trauma bevirker ikke bare en skarp restrukturering av stromale vev i kyuretirovannoy ben, men også betydelige endringer i stroma fjerntliggende ben intakt, dvs. At det er en systemisk reaksjon stromalvev for lokal traumer. Og når den anvendes polytrauma - multiplum utskrapning - denne reaksjonen blir forsterket og observeres ikke bare i det opererte ben og fjerne deler av skjelettet, men også i de lymfoide organer, særlig milt. Mekanismen for en slik systemisk respons av beinmargstromvev og milt for lokalt traume og polytrauma er fortsatt ukjent. Det antas at denne prosessen er assosiert med effekten av den humoralfaktor frigjort av mesenkymalstromen i knoglemarvets medullære hulrom. Muligheten for å gjøre stromale benmargsceller og milt organonespetsificheskogo humoral faktor som er ansvarlig for celle-proliferasjon, kolonidannende fibroblaster indikerer data om deres kolonistimulerende aktivitet hos monokulturer av benmarg.

I denne forbindelse er det verdt å merke seg at når de administreres systemisk multipotente mesenchymal forløperceller repopulerende deres derivater ikke bare benmargen, men også andre vev, som brukes, særlig ved genterapi. Det er vist at etter intravenøs administrering av store mengder av MSCene med genomet av villtype mus med mutant kollagen gen I donorceller erstatte opp til 30% av cellene i ben- og bruskvevet til mottakeren, og de transfekterte mesenchymale stammen museceller som utskiller IL-3 menneske, i 9 måneder effektivt å støtte hematopoiesis i tilfelle av deres samtidige administrasjon av humane hematopoietiske stamceller i immundefekte mus.

[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14]

Genetisk modifikasjon av mesenkymale stamceller

Ytterligere eksperimentelle suksess av den genetiske modifikasjon bør bemerkes MSCer transfeksjon faktor IX-genet i humane MSCer, etterfulgt av overføring av celletransfektanter immunodefekte mus, noe som fører til utseendet i blodet antihemofilifaktor B i løpet av 8 uker etter transplantasjon. I dette forsøket ble posttranslasjonell modifikasjon av faktor IX med y-glutamylkarboksylase utført i transfekterte celler. Transduksjon av MSC-ene med en retroviral vektor som koder for human faktor IX, har vært mindre vellykket - påfølgende innføring av disse cellene med hemofili hund i et terapeutisk nivå av faktor IX, som understøtter normal intensitet koagulering hemostase, bare i 12 dager.

Transplantasjon av mesenkymale stamceller i hjernens parenchyma har vist at donor umodne celler transformeres både i populasjonen av nevroner og glia. Innpoding neuronale derivater frisk donor mesenkymale vev gjør teoretisk mulig korreksjon av genetiske abnormiteter i hjernemetabolisme hos pasienter med Gauchers sykdom og andre forstyrrelser i lipid metabolisme, karbohydrat eller gangliosider.

Fortsetter eksperimentelle søkebetingelser transdifferensiering av stamceller i benmarg-forløperceller stromal i nerve- og levervevet. Forskernes oppmerksomhet er fokusert på kombinasjoner av differensieringsinduktorer og spesielle kondisjoneringsmedier. Spesielt, for å isolere den primære kultur med 10% føtalt kalveserum, benmarg stromale celler vasket og resuspendert i DMEM / F12-kulturmedium (1/1) blir sådd ved en tetthet på 200.000 / cm2. Etter 24 timer fjernes ikke-adherente celler, og fibroblastlignende celler festet til plasten dyrkes i en uke. For differensiering av stromale benmargsceller til neuroblaster brukes kondisjonert medium oppnådd ved dyrking av tre-dagers kultur av primære muse embryonale fibroblaster, såvel som på den DMEM / F12 (1/1) med 2% føtalt kalveserum og supplert med 20 ng / ml eller 10-6 M LiF retinsyre (nevoinduktorer, som brukes til neural differensiering av mus og menneskelige embryonale stamceller). Differensieringen av stromale benmargsceller inn i stamceller til hepatocytter ble indusert kondisjonert miljø skapt som et resultat av tre-dagers dyrking av en primær kultur av embryoniske muse leverceller i DMEM / F12 (1/1) medium supplementert med 10% føtalt kalveserum.

Her skal det bemerkes igjen at de kolonidannende cellene i beinmargstroma er heteromorfe og kan deles inn i to typer. Den første typen inkluderer fibroblastlignende celler som danner filopodia celler med store kjerner og en eller to nukleoler. Den andre typen er representert av små celler med en spindelformet form. I begge typer av cellekultur i det kondisjonerte medium oppnådd på et matelag av primærmuse embryonale fibroblaster, og på den Z-4-te dag i kultur celler synes lik neuroblasts. På dette stadiet har de ofte en spindelformet form med en eller to lange prosesser som slutter med filopodi. Pyramidale eller stellatceller med korte dendriter er mindre vanlige. Dendritter ett neuroblasts har typisk utvidelse (nyre vekst) og forgrening i dens distale del, den andre - sammen med en tydelig vekst kjegler filopodia, gjennom hvilken dendritt vekst opptrer. Lignende morfologiske egenskaper (nyre vekst kjegler og filopodia a) iboende neuroblastom, differensiere til neuroner, er beskrevet i detalj i papirer med neurogenese. På denne bakgrunn konkluderer noen forfattere at cellene de oppdager i kultur er neuroblaster. Spesielt Schegelskaya E. Et al (2002), etter en primær kultur av stromale celler dyrket i to uker i en utskiftbar ved hver Z-og-4de dag kondisjonert medium funnet at en del av de prolifererende celler, har beholdt den udifferensiert tilstand. Utad, så slike celler som fibroblaster og ble identifisert i kultur sammen med differensierende neuroblaster. De fleste cellene (ca. 80%) var på forskjellige stadier av differensiering i celler i nervesystemet, hovedsakelig i neuroner. De dendritiske prosessene til disse cellene nærmet seg hverandre, slik at de gradvis dannet cellene på substratseksjonene i nervenettverket i form av lange multicellulære tråder. Dendritiske prosesser av neuroblaster vokste mye lenger, noen av dem 8-10 ganger høyere enn lengden av selve nervens kropp. Gradvis økte andelen pyramidale og stellatceller. Dendriter av stellatceller forgrenet. Ifølge forfattere, svarer den senere differensiering av pyramidale og stellatceller i sammenligning med spindelformede sekvenser av stadier av normal neurogenese hos dyr. Som et resultat, konkluderes det med at stamcellene til stromale benmargsceller eksponeres induseres nevrogenesen i hvilken prosess in vitro-genererte neuroblasts fra alle tre hovedtyper av nerveceller. Forgjengere av nerveceller ble også detektert under dyrking av beinmargstromaceller i 3-4 dager i medium med 2% føtal serum og 20 ng / ml LIF. Men i dette tilfellet stamceller ble delt veldig sakte, skjedde differensieringen av neuroblaster bare i 30% av tilfellene, og de dannet ikke nevrale nettverk. Ved å bruke som et nervecelledifferensieringsinduse retinsyre, forfatterne oppnådd i kulturen til 25-30% av nervecellene med en overvekt av gliaceller - astrocytter og oligodendrocytter. Neuroner utgjorde bare en tredjedel av alle nervceller, selv om de var representert av alle tre typer: fusiform, pyramidale og stellate celler. På den 6. Dag av dyrking av stromale celler i retinonsyre mellomnerveceller ble mer differensiert, mens individuelle axoner av pyramidale neuroner ble funnet at i den normale neuroontogenesis vises senere dannelse av de dendrittiske prosesser. Ifølge forfatterne, til tross for det lave utbytte av nerveceller, metoden for indusering av retinsyre har fordeler: astrocytter og oligodendrocytter og myelinerende operere matefunksjonene under veksten av aksoner og dendritter, og er nødvendige for normale nervevevet formasjon. Derfor, for å reparere sine skadede steder in vivo, er det bedre å bruke en suspensjon av nevroner beriket med glialceller.

I den andre forsøksserie, forfatterne forsøkte å indusere differensiering av stromale benmargsceller i levercellene. Etter tre dagers kultur av stromale benmargsstamceller i det kondisjonerte medium oppnådd ved å inkubere mus embryonale hepatocytter, er store, kuleformede celler er funnet, ofte to-atom, cytoplasma-inneslutninger med forskjellige størrelser. Disse cellene var på forskjellige stadier av differensiering og varierte i størrelse, antall kjerner og inneslutninger i cytoplasma. I de fleste av disse cellene ble glykogen detektert, på grunnlag av hvilke forfatterne identifiserte dem som stamceller fra hepatocytter. Siden kulturen ingen celler ble detektert likhet med neuroblasts, etterfulgt av en konklusjon som i det kondisjonerte mediet som oppnås ved dyrkning av embryoniske hepatocytter, er det ingen faktorer for differensiering av nerveceller og omvendt, er det faktorer som induserer differensiering av stromale benmargsceller inn i progenitorceller av hepatocytter . Forfatterne antyder nærvær av pluripotente celler fra benmargstroma, som de skiller in vitro i celler med nedsatt eller neuralt vev, avhengig av de spesifikke, kondisjonert medium, og induktorer.

I enkelte arbeider er differensieringen av beinmargstromaceller i kardiomyocytter, brusk, bein og nevrale vevceller faktisk korrekt vist. Det er opplysninger som blant cellene i beinmargen er det populasjoner av stamceller som kan skille seg inn i hepatocytter. I lys av disse resultatene ovenfor angitte forsøk i mus kan likevel betraktes som en bekreftelse på nærværet i benmargen pluripotente stamceller som har evne til å differensiere til celler av forskjellige vev i voksen organismen.

Transplantasjon av mesenkymale stamceller

I klinisk transplantasjon av humane stamceller kan benyttes for ekspansjon av hematopoetiske stamceller og deres etterkommere tidlige prekommitirovannyh. Spesielt innføring av autologe hematopoetiske stamceller og MSCer kreftpasienter etter kjemoterapi ved høy raskere bedring i neutrofiler og blodplater i perifert blod. Autolog og allogen transplantasjon av stamceller som brukes for å behandle multippel myelom, aplastisk anemi, trombocytopeni spontan - sykdommer assosiert med primær defekt hematopoietisk stromalvev. Effektiviteten av celleterapi i hematologiske sykdommer i mange tilfeller ovenfor, mens innføring av stromal og hemopoietiske stamceller, som oppviste en reduksjon av den postoperative pasienter, i blod, reduksjon i antall dødsfall som følge av ikke-selektive destruksjon regionale og sirkulerende kreftceller som formen og dens egen forløperceller hematopoetiske pasientens celler. MSCS lovende programmer og andre multipotente mesenchymale forløperceller i klinisk praksis på grunn av deres relativt lette måten å oppnå benmarg aspirater, ekspansjon i kultur og transfeksjon av det terapeutiske gen. For således å kompensere for lokale vevsdefekter kan bruke en lokal implantering av multipotente mesenchymale forløperceller, og i systemisk dysfunksjon av vev av mesenchymal opprinnelse er ikke utelukket deres innføring inn i den generelle sirkulasjon.

Mer forsiktig i sine argumenter forfatterne av arbeidene i hvilke perspektiver av MSC-ene for lokal, systemisk transplantasjon og genterapi analyseres fra det synspunkt av biologi stromale celler. Postnatal benmarg er tradisjonelt ansett som et legeme sammensatt av to hovedsystemer av forskjellige cellelinjer - faktisk hematopoietisk vev og dets tilhørende støtte stroma. Derfor, benmarg stamceller opprinnelig betraktet bare som en kilde for stromal basis for produksjon av regulatoriske faktorer hematopoetiske mikromiljøet. Derefter endret forskerne oppmerksomheten til å studere rollen som MSC som stamme kilde til skjelettvev. De nyeste dataene indikerer et uventet potensial for differensiering av beinmargestromceller med dannelsen av et neuralt eller muskelvev. Med andre ord, de stamceller oppviser transgermalnuyu plastisitet - evnen til å differensiere i celletyper som fenotypisk ikke-originalt vev celler. Men noen aspekter av biologien til stromale benmargsceller forblir uklare og uløst generelt biologisk plan, og i noen detalj, inkludert identifikasjon, natur, opprinnelse og utvikling og funksjon in vivo stromale benmargceller, så vel som den tillatte potensiell differensiering ex vivo og muligheten terapeutisk bruk in vivo. Dataene på de potensielle muligheter for MSC-er, så vel som resultatene av studier av andre regenerative potensialet av stamceller, i skarp kontrast til den etablerte dogma i biologi.

Når de dyrkes under lave tetthetstilstander, danner beinmargestamstromceller tydelige kolonier, som hver er et derivat av en enkelt forløpercelle. Prosentandelen av stromale celleforløpere i benmarg nukleære celler definert ved deres evne til å danne kolonier i stor grad er avhengig av dyrkningsbetingelsene og arten av MSCene tilhører. For eksempel, i den gnager for å oppnå den maksimale mengde av stromale progenitorceller er absolutt nødvendig i nærvær av bestrålt mater kultur av benmargceller og serum, mens den kolonidannende effektivitet av humane stamceller er uavhengig av materen eller fra kulturmediet. Antallet kjente mitogene faktorer som stimulerer proliferasjonen av stromal stamceller er begrenset. Disse inkluderer PDGF, EGF, FGF, TGF-b og også IGF1. Under optimale betingelser, dyrking av MSC-ene polyklonale linjer opprettholdt in vitro i mer enn 50 celledelinger, som gjør det mulig å motta milliarder av stromale benmargsceller fra 1 ml av aspirate det.

Imidlertid er populasjonen av stromale benmargsceller heterogen, som manifesterer seg som variasjoner i størrelsen av koloniene, annen sats av deres dannelse, og en rekke av cellemorfologi, som omfatter en rekke fibroblast-lignende spindel til store flate celler. Med utviklingen av slike avlinger etter 20 dager, er også fenotypisk heterogenitet notert. En del av kolonien er karakterisert ved høy ekspresjon av alkalisk fosfatase, ikke andre ikke uttrykker det, og den tredje typen koloniene fosfatazopozitivnymi i det sentrale område og fosfatazonegativnymi på periferien. Separate kolonier danner knuter med knottvev (begynnelsen av matriksmineraliseringen er merket når de er farget med alizarinrød eller på kalsium av Van-Koss). I andre kolonier finner fettakkumulering sted, identifisert ved G-farging med olje rødt. Mindre ofte danner koloniene i mesenkymale stamceller brusk som er farget med alcyanblå).

Etter ektopisk transplantasjon i forsøksdyr polyklonale MGK linjer form ektopisk ben stroma med setchatoobraznoy forbundet med myelopoese og adipocytter, i tillegg, men sjelden, med bruskvev. I monoklonalt linjer transplantasjon av stromale benmargsceller i visse tilfeller er det kimerisme, karakterisert ved at de novo dannet benvev er sammensatt av benceller, omfatter adipocytter stroma og donor opprinnelse, mens cellelinjer av hematopoietisk og vaskulære system er avledet fra mottakeren.

Resultatene av disse studiene bekrefter stammenegenskapen til stromal benmargprekursor, hvorfra klonlinjen ble oppnådd. De viser også samtidig at ikke alle kloning i kulturceller er faktisk multipotente stamceller. Noen forskere mener, og vi deler deres mening, at den mest nøyaktige informasjon om den virkelige potensialet i differensiering av individuelle kloner kan bare oppnås in vivo etter transplantasjon, snarere enn ved å bestemme fenotype av deres derivater in vitro. Ekspresjon i osteo- kultur fenotypiske markører hondro- eller adipogenese (bestemt ved mRNA eller via histokjemiske teknikker), og til og med produksjon av mineraliserte matrise ikke gjenspeiler graden av pluripotency enkelt klon in vivo. Derfor er identifikasjonen av stamceller i stromalcellegruppen bare mulig etterfølgende under de rette betingelser for en biologisk transplantasjonstest. Spesielt brusk meget sjelden observert i transplantasjons åpne systemer, mens dannelsen av brusken er ikke uvanlig i lukkede systemer, for eksempel diffusjonskamre eller i mikromassnyh kulturer av stromale celler in vitro, karakterisert ved oppnås lokalt lav oksygenspenning, bidrar til dannelse av brusk. Derfor påvirker selv transplantasjonsmetoden, så vel som ikke-spesifikke dyrkningsbetingelser for in vitro, signifikant rekkevidden av MSC-differensiering.

Eksperimentell transplantasjon med overholdelse av givne eksperimentelle forhold er den gylne standarden for å bestemme potensialet for differensiering av benmargstromceller og nøkkelelementet i deres korrekte identifikasjon. Historisk er knoglemarvstrombeinmargstransplantasjonsstudier forbundet med et vanlig benmargstransplantasjonsproblem. Det ble etablert at hemopoietisk mikromiljø er opprettet ved transplantasjon av beinmargstromceller og gir ektopisk utvikling av hemopoietisk vev i transplantasjonssonen. Opprinnelsen til mikromiljøet fra giveren og hematopoietisk vev - fra verten tillater oss å behandle ektopisk bein som en ekte "invertert" beinmargstransplantasjon. Lokal transplantasjon av beinmargstromceller fremmer effektiv korreksjon av beindefekter, mer uttalt enn ved spontan reparativ regenerering. I flere prekliniske studier i dyremodeller overbevisende vist seg muligheten for transplantasjoner av stromale benmargsceller i ortopedi, selv om for å optimalisere disse fremgangsmåter, selv i de enkleste tilfeller krever den mest omhyggelige arbeid og analyse. Spesielt er de optimale forholdene for ekspansjon av osteogene stromceller ex vivo ennå ikke blitt fastslått, strukturen og sammensetningen av den ideelle bæreren forblir ubenyttet, så vel som antall celler som er nødvendige for bulkbensregenerering.

I tillegg til å bruke formerte ex vivo-stromale benmargsceller for tilheling av mesenkymal opprinnelse utradisjonelle duktilitet MSC åpnes potensiell bruk for regenerering av nerveceller, eller levering av genprodukter i CNS. I prinsippet forenkler dette cellulær terapi i nervesystemet, siden det ikke er behov for å oppnå autologe nevrale stamceller fra mennesker. Det er rapportert om mulighetene for bruk av benmargceller for generering av kardiomyocytter og myogene forløperceller som en virkelig stromal og ekstrinsisk opprinnelse.

Eksperimenter pågår ved systemisk transplantasjon av benmargstromceller for behandling av vanlige skjelettsykdommer. Ingen tvil om at stromale benmargsceller er en populasjon ansvarlige for genetiske ved sykdommer i skjelettet, som er godt illustrert av vektoren overføring ved hjelp av genetiske informasjon i cellene, noe som fører til dannelse av patologiske benvev hos forsøksdyr. Imidlertid er muligheten for stromalceller til å implantere, vokse, formere seg og differensiere i beinene i skjelettet etter innføring i den generelle blodstrømmen ennå ikke blitt bevist.

Dette er delvis på grunn av det faktum at standard prosedyre for benmargstroma ikke er transplantert med hematopoietisk vev, så strenge kriterier for evaluering av vellykket innpoding av systemisk administrasjon av stromale celler er ennå ikke utviklet. Det skal huskes at tilstedeværelsen av markørgener i vevekstrakter eller isolasjonen i kulturen av celler av donor-opprinnelse indikerer ikke om engraftment av celler, men bare deres overlevelse. Selv intra-arteriell injeksjon av stromale benmargsceller i mus lem kan føre til praktisk talt null resultat innpoding, til tross for det faktum at donor-avledede celler er funnet i store mengder inne i mikrovaskulær benmargen nettverk. Dessverre blir slike celler vanligvis beskrevet som "engrafted" bare på grunnlag av resultatene av bestemmelsen av markør-donorgener under dyrkningsbetingelser ex vivo. I tillegg er det nødvendig å gi overbevisende bevis på langsiktig integrering i vev av differensierte og funksjonelt aktive celler av donor-opprinnelse. I mange publiserte verk, hvor det er rapportert om engraftment av beinmargstromceller i skjelettet, er mangelen på klare data av denne typen slående. Ikke desto mindre bør det bemerkes at i noen riktige forsøk på dyr er imidlertid en begrenset, men reell engraftment av stromal stamceller etter deres systemiske administrasjon, etablert.

Disse dataene stemmer overens med resultatene av studien av muligheten for å levere myogene beinmargsforløperceller til musklene gjennom det vaskulære systemet. Det skal imidlertid ikke glemmes at både skjelett og muskelvev dannes under utvikling og vekst på grunnlag av ekstravaskulære cellebevegelser som bruker migreringsprosesser som ikke involverer blodsirkulasjon. Hvis det egentlig eksisterer en uavhengig sirkulasjonsvei for levering av forløperceller til fastfasevev, er det mulig å tillate eksistensen av fysiologisk sirkulerende mesenkymale stamceller? Hva er opprinnelsen til disse cellene i både utviklings- og postnatal organismen, og hvordan trenger de inn i vaskemuren? Løsningen av disse problemene er absolutt nødvendig og krever den mest grundige prekliniske analysen. Selv etter at svarene på disse spørsmålene er funnet, forblir de problematiske kinetiske aspektene knyttet til skjelettvekst og remodeling av bindevev uløst. Samtidig synes behandling av osteogeneseforstyrrelser ved å erstatte hele populasjonen av muterte skjelettprogenitorceller med friske stromalceller et reelt klinisk perspektiv. I dette tilfellet kan lokale soner av brudd eller deformasjon på grunn av patologisk osteogenese, samt destruktiv endring i beinvev, korrigeres ved dyrkede in vitro stromale stamceller. Derfor bør retningen for fremtidig forskning fokuseres på problemene med transformasjon eller genetisk korreksjon av autologe muterte osteogene stamceller ex vivo.

Genetisk modifisering av celler, midlertidig eller permanent, ble grunnlaget for cellen og molekylær biologi, kilden til mange vitenskapelige funn vedrørende rollen til individuelle proteiner i cellulær metabolisme in vitro stoffer og in vivo. Bruken av molekylære teknikker for å korrigere arvelige sykdommer og sykdommer hos mennesker er svært lovende for praktisk medisin, fordi egenskapene til stromal benmarg stamceller lov til å utvikle unike kretser transplantasjon for korrigering av genetiske sykdommer i skjelettet. I dette tilfellet kan de mesenchymale stamceller hentes ganske enkelt fra fremtiden mottaker, de er mottagelig for genetisk manipulasjon og er i stand til å formere seg i store antall i løpet av kort tid. Bruken av mesenkymale stamceller unngår begrensningene og risikoene forbundet med levering av genetisk informasjonsmateriale direkte til pasienten gjennom vtruvøse vektorkonstruksjoner. Denne strategien er anvendelig til pi-embryonale stamceller, men etter fødselen autologe stromale benmargsceller - et foretrukket materiale fordi deres administrasjon utelukker mulige immunologiske posttransplantation komplikasjoner. For å oppnå en kortvarig virkning, for eksempel for å akselerere benregenerering, er den optimale metode for genetisk modifikasjon av stamceller ved å bruke elektroporatsrsh, kjemisk fusjon, lipofeksjon, plasmider og adenovirus-konstruksjoner. Spesielt var viral transfeksjon i benmargstromal BMP-2-celler effektiv for å akselerere regenerering av bein i eksperimentell polytrauma. Opprettelse av adenovirale vektorkonstruksjoner er foretrukket på grunn av fraværet av toksisitet. Imidlertid er den genetiske modifikasjon av benmargstromceller i dette tilfelle karakterisert ved ekstremt lav stabilitet. I tillegg krever normal transformerte benmargstromceller bruken av vektorbærere av genetisk informasjon 10 ganger mer smittsom enn andre celletyper, noe som signifikant øker prosentandelen av dødsfallet til transfekterte celler.

For behandling av recessive sykdommer forårsaket av lav eller ingen biologisk aktivitet av visse gener som er nødvendig for langvarig eller permanent modifisering av stamceller, som krever bruk av adenoassosierte virus, retrovirus, lentiviruser og adeno-retroviral kimær. Transportsteder av disse virusene er i stand til å transportere store DNA-transfekter (opptil 8 kb). Den vitenskapelige litteratur har allerede dukket opp informasjon om biologisk aktivitet av eksogene stromale benmargsceller transfektert med retrovirale konstrukter som koder for syntese av regulatoriske molekyler, og markører - IL-3, CD2, faktor VIII, og de som er involvert i syntesen av L-DOPA-enzymer. Men i disse verkene påpeker forfatterne en rekke begrensninger som må overvinnes før den praktiske anvendelsen av denne teknologien begynner. Det første problemet er å optimalisere MCK ex vivo modifikasjonsprosessen. Det er kjent at en langvarig (3-4 uker) proliferasjon av benmargstromceller in vitro reduserer transfeksjonen. Samtidig er det nødvendig med flere sykluser av transfusjon for å oppnå et høyt nivå av genetisk modifikasjon av MSC. Det andre problemet er relatert til varigheten av uttrykket av det terapeutiske genet, som ennå ikke overstiger fire måneder. En naturlig reduksjon i effektiv genuttrykk skyldes inaktivering av promotorer og død av modifiserte celler. Generelt utsikter overføring av genetisk informasjon ved hjelp av stamceller resultatet av de innledende studier indikerer behovet for ytterligere optimalisering av transfeksjonsmetoder ex vivo, å velge en tilstrekkelig promoter som regulerer den biologiske aktivitet i den riktige retning, og forbedre evnen til de modifiserte stromale benmargsceller til å fornye seg selv in vivo etter transplantasjon. Det skal bemerkes at bruken av retrovirale konstrukter for modifikasjon av stromale benmargsceller i den ønskede retning ikke alltid krever sin obligatorisk innpoding. Transfektert mesenchymal stamcelle kan utføre en korrigerende funksjon på bakgrunn av stabile og oppholds uten å kreve fysisk aktiv inkorporering og fungerer i bindevevet. I dette tilfellet bør de bli sett på som et biologisk mini-pumpe, som produserer faktor in vivo, mangel på som bestemmer manifestasjonen av en genetisk sykdom.

Anvendelse av transform stromale benmargsceller for behandling av dominant arvelig sykdom som er kjennetegnet ved ekspresjon av genet eller unormal patologisk biologisk aktivitet, er mye mer problematisk, fordi i dette tilfellet er det nødvendig å blokkere overføring eller salg av den genetiske informasjonen forvrengt. En av metodene for genteknologi er den homologe rekombination av embryonale stamceller for å skape transgene dyr. Det er imidlertid usannsynlig å fremme utstrakt bruk av denne teknikken i nær fremtid ekstremt lavt nivå av homologt rekombinant, kombinert med problemene med identifisering, separering og utvidelse av disse rekombinanter, selv om utviklingen av nye teknologiske metoder. Den andre tilnærmingen til genterapi er basert på de viktigste patologien automatisk korreksjon av skadet DNA som genetiske mutasjoner kan korrigeres ved innføring av eksogent DNA med den ønskede sekvens (kort DNA-oligonukleotider, eller kimære RNA / DNA-oligonukleotider) som bindes til homologer i den skadede genomet. Den tredje utførelsesform tilveiebringer patologisk informasjonsoverføring lås som oppnås ved bruk av spesielt utviklet oligonukleotider som binder til et spesielt gen for dannelse av ternære spiralformet struktur, noe som utelukker muligheten for transkripsjon.

Selv om korreksjon av genetiske sykdommer i genomet nivå er optimal og foretrukne terapeutisk metode, er mRNA også en lovende vektor (kanskje enda mer tilgjengelig) for sperring av en dominant negativ gen. For å hindre oversettelse og / eller øke mRNA degradering har lenge vært brukt sammen med proteinmolekyler Antisens oligonukleotid-sekvenser eller fullstendig blokkering av binding av mRNA biosyntetiske apparat av cellen. I tillegg induserer dobbeltstrenget RNA hurtig nedbrytning av mRNA, hvor mekanismen forblir uklar. Imidlertid er det usannsynlig at den bare fjerning av mRNA transkribert fra et mutant allel med korte eller enkeltmutasjoner vil gi mRNA-ekspresjon av den normale allelet. Et alternativ er å bruke ribozinov hammer og hårnål, har evnen til å binde til meget spesifikke områder av mRNA med påfølgende induksjon av sin spaltning og inaktivering i løpet av oversettelse. For tiden studeres muligheten for bruk av denne metoden ved behandling av patologisk osteogenese. Uavhengig av hva som er det målet - genomiske eller cytoplasmatiske elementer suksess for ny genterapi teknologi vil bli bestemt av effektiviteten av inkludering av reagenser i stromale benmargsceller ex vivo, det optimale valg av en spesiell vektor og stabil evne av mesenchymale stamceller som uttrykker de ønskede faktorer in vivo.

Dermed oppdager oppdagelsen av mesenkymale stamceller med deres uventede egenskaper en ny konseptbasert plan for utvikling av cellelinjer. Men for å forstå den biologiske rolle av stromal stamceller, av deres natur, evnen til å transdifferensiering eller dedifferensiering, deres fysiologisk betydning i prosessen med embryoutvikling, postnatal vekst, modning og aldring, så vel som i humane sykdommer kreve ytterligere tverr forskning.