Ett ampulle, to mål: Bærbar CRISPR-basert tuberkulosediagnose med 100 % sensitivitet

En artikkel om en bærbar tuberkulosetest som kan gjøres direkte fra sputum, uten komplekst utstyr, ble publisert i Science Advances. Isotermisk DNA-amplifisering og CRISPR-avlesning kombineres i et enkelt reagensrør; to konservative M. tuberculosis-innsettinger (IS6110 og IS1081) testes samtidig, pluss et humant gen som en intern prøvekontroll. I en liten «blind» test på kliniske prøver ga testen 100 % sensitivitet (6/6) og 100 % spesifisitet (7/7) sammenlignet med kultur; deteksjonsgrensen er ~69–81 CFU/ml i simulert sputum. Resultatet kan sees på en papirteststrimmel, og reagensene frysetørkes (lagring uten «kaldkjede»).

Bakgrunn

Ifølge WHO vil tuberkulose drepe rundt 1,25 millioner mennesker i 2023. Tuberkulose har igjen blitt den ledende smittsomme dødsårsaken, med anslagsvis 10,8 millioner tilfeller. Dette gjør tilgjengelig og rask diagnostikk kritisk, spesielt i ressursbegrensede miljøer.

• Nåværende tester er et kompromiss mellom nøyaktighet, hastighet og pris. «Gullstandarden» for kultur er svært nøyaktig, men treg; mikroskopi er rask, men ufølsom; PCR-plattformer som Xpert MTB/RIF Ultra er betydelig mer følsomme (LOD ≈ 15,6 CFU/ml), men krever dyrt utstyr og patroner, noe som begrenser dekningen.
• Hvorfor isotermisk og CRISPR. Isotermisk RPA-amplifisering fungerer ved 37–42 °C og krever ikke termiske syklere – praktisk «i felten». CRISPR-avlesning (Cas12/13) gir artsspesifisitet og tillater visuell lateral strømning («stripe») uten kompleks optikk. Alt i alt er dette veien til bærbare og billige PVR-tester.
• Hvorfor to MBT-mål samtidig (IS6110 + IS1081). IS6110 er et flerkopiinnlegg av M. tuberculosis- komplekset, men noen linjer har få kopier, og tester for IS6110 alene kan «bomme». Å legge til et andre IS1081-innlegg reduserer risikoen for falskt negative resultater.
• Hvorfor intern menneskelig kontroll. Pusteprøver kan inneholde inhibitorer og "dårlige" prøver. Endogen menneskelig kontroll (f.eks. RNase P/genomisk DNA) bekrefter at materialet er tilstrekkelig og at reaksjonen ikke undertrykkes – ellers kan ikke resultatet anses som negativt.
• Formatet med én beholder er viktig i seg selv. Det reduserer antall trinn, reduserer risikoen for kontaminering og forenkler arbeid utenfor laboratoriet. Slike tilnærminger for tuberkulose har allerede vist seg levedyktige; det nye arbeidet utvider ideen til et format med to mål med interne kontroller, i tillegg til at det demonstrerer frysetørking av reagenser og en stripeavleser.
• Hva er verdien av denne artikkelen? Forfatterne demonstrerte deteksjon direkte fra sputum etter den mest forenklede prøveprepareringen, deteksjonsgrensen på ~70–80 CFU/ml i simulert sputum, og 100 % sensitivitet/spesifisitet på et lite blindsett av kliniske prøver – en god «teknisk demonstrasjon» for videre multisentervalideringer.

Hvordan fungerer dette

• Forskerne kombinerte RPA (rask isotermisk amplifisering av genetisk materiale ved 37 °C) med de «kuttede» enzymene Cas13a/Cas12a. Etter å ha valgt guide-RNA-ene, konfigurerte de systemet til å målrette to MBT-mål samtidig, og parallelt med menneskelig DNA (og sjekke at det i det hele tatt er materiale i prøven og at reaksjonen ikke har «stanset»).
• All kjemien går i ett reagensrør; etter inkubasjon avleses resultatet enten med et fluorimeter eller på en lateral strømningsstripe – i hovedsak som en ekspresstest.
• Sputumbehandling er forenklet til oppvarming og en kort sentrifuge – uten nukleinsyreekstraktorer. For de mest begrensede forholdene diskuterer forfatterne til og med manuelle alternativer til sentrifugen.

Hva testene viste

• Deteksjonsgrense: 69,0 CFU/ml (stamme H37Rv) og 80,5 CFU/ml (BCG) i «spike»-sputum. Ingen kryssreaktivitet med andre bakterier/sopp ble påvist.
• Klinisk setting (blindede prøver): på 13 prøver fra reell praksis - 100 % sensitivitet (6/6) og 100 % spesifisitet (7/7) i forhold til såing. Til sammenligning viste GeneXpert Ultra henholdsvis 100 %/86 % på samme sett.
• Tekniske nyanser: Av de to avlesningsalternativene fungerte Cas13a bedre (for «one-pot»-formatet er det mer følsomt enn Cas12a). I tillegg reduserer parallell testing av to Mtb-mål risikoen for falske resultater.

Hvorfor er dette nødvendig?

Dagens tester er et kompromiss mellom nøyaktighet, hastighet og tilgjengelighet: kultur er svært nøyaktig, men treg; vattpinner er raske, men unøyaktige; PCR-systemer som GeneXpert er nøyaktige og raske, men krever dyre instrumenter og patroner. Den nye CRISPR-tilnærmingen tar sikte på å lukke gapet: feltdiagnostikk som opererer ved 37 °C, med papirstrimmelavlesninger, og potensialet til å lagre reagenser uten kjøling.

Begrensninger og hva som skjer videre

Dette er en tidlig demonstrasjon på et lite klinisk sett – store, multisentertester er nødvendige (inkludert HIV-koinfeksjon, hos barn, med paucibacillære former og forskjellige MBT-linjer). Forfatterne bemerker separat at i selve «felt»-versjonen må bordsentrifugen erstattes med en helt manuell løsning. Men selve arkitekturen – «to mål + intern kontroll» i ett reagensrør – har allerede bevist sin driftssikkerhet og gir en klar vei til forbedring for massebruk.

Kilde: Alexandra G. Bell et al. En strømlinjeformet CRISPR-basert test for tuberkulosepåvisning direkte fra sputum, Science Advances, online 6. august 2025 (bind 11, utgave 32). DOI: 10.1126/sciadv.adx206